芍藥花色形成相關(guān)miRNA的挖掘及功能分析研究.pdf

1、芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）是中國(guó)的傳統(tǒng)名花之一，自古以來(lái)就有“花相”的美譽(yù)。因其具有極高的觀賞價(jià)值而被廣泛應(yīng)用于植物造景和庭院綠化中，目前在世界眾多國(guó)家廣為栽培?；ㄉ怯^賞植物最重要的性狀之一，其直接影響著植物的觀賞價(jià)值和商業(yè)品質(zhì)。芍藥花色豐富，可以分為9大色系，但目前對(duì)于芍藥花色的研究主要集中于色素測(cè)定、結(jié)構(gòu)基因的克隆與表達(dá)分析和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析等方面，雖然初步明確了芍藥花色形成的代謝和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，但對(duì)于

2、miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制尚不清楚，而明晰芍藥花色形成相關(guān)的miRNA及調(diào)控機(jī)制對(duì)于全面闡明芍藥花色形成機(jī)理、培育珍稀花色新品種意義重大。為此，本研究以外瓣紅色、內(nèi)瓣黃色的芍藥復(fù)色品種‘金輝’為材料，通過(guò)miRNA測(cè)序鑒定芍藥內(nèi)、外瓣差異表達(dá)miRNA、篩選調(diào)控花瓣色澤形成的候選miRNA及其靶基因、明確關(guān)鍵miRNA調(diào)控色澤形成的轉(zhuǎn)錄后機(jī)制。主要結(jié)果如下:
　　(1)對(duì)影響花色形成的理化因子研究發(fā)現(xiàn)，色素分布、表皮形狀、細(xì)胞

3、液pH值、有機(jī)酸含量和礦質(zhì)元素含量并不與芍藥內(nèi)、外瓣色澤差異形成具有顯著相關(guān)性。隨后，構(gòu)建了內(nèi)、外瓣miRNA文庫(kù)并進(jìn)行測(cè)序，在去除低質(zhì)量的reads后，分別從內(nèi)、外瓣6組樣品中獲得超過(guò)96.54％的高質(zhì)量clean reads，拼接后共獲得1，756，525和2，045，228條miRNA，共有331個(gè)已知的miRNA和66個(gè)新預(yù)測(cè)的miRNA在6組樣品中表達(dá)含量不一致。通過(guò)差異分析共得到163個(gè)已知的差異表達(dá)miRNA和28個(gè)新預(yù)測(cè)

4、的差異表達(dá)miRNA;而在已知的差異表達(dá)miRNA中，80個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)，83個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào);在新預(yù)測(cè)的差異表達(dá)miRNA中，18個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)，10個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，并對(duì)其靶基因進(jìn)行了功能注釋為生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。通過(guò)隨機(jī)對(duì)獲得的miRNA前體序列進(jìn)行亞克隆和表達(dá)模式進(jìn)行檢測(cè)均驗(yàn)證了miRNA測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。
　　(2)通過(guò)比較3種小RNA提取方法，發(fā)現(xiàn)改良多步法提取芍藥花瓣小RNA效果較好，提

5、取的miRNA質(zhì)量高，穩(wěn)定性好，能夠滿足芍藥miRNA方面的研究。通過(guò)將miRNA測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析，根據(jù)靶基因的功能共篩選出miR156e-3p、miR828a、miR156d、miR2616和Novel-miR25等5個(gè)調(diào)控芍藥花色形成的候選miRNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)對(duì)候選miRNA及其靶基因在不同發(fā)育時(shí)期花瓣中的表達(dá)模式進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，miR156e-3p及其靶基因Unigene1041

6、1表達(dá)趨勢(shì)呈顯著負(fù)相關(guān)性，在對(duì)miR156e-3p的靶基因Unigene10411序列進(jìn)行克隆比對(duì)，其與其他物種SPL(squamosa promoter-binding-like protein)基因相似性達(dá)81％以上，命名為PlSPL1。
　　(3)構(gòu)建了以miR156e-3p前體序列為目的基因的表達(dá)載體，利用液氮凍融法將載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，采用擬南芥花序浸染法獲得轉(zhuǎn)基因植株，并采用培養(yǎng)基篩選、GUS染色、PCR擴(kuò)增、qRT-PC