與鴨子黑色和白色羽毛色素沉著關(guān)聯(lián)的microRNA的分析鑒定.pdf

1、基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的一個(gè)主要機(jī)制是通過(guò)microRNA(miRNA)實(shí)現(xiàn)的。單個(gè)的miRNA可以在多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如細(xì)胞增殖和分化、凋亡和癌變。然而，由哪些特定miRNA可能調(diào)節(jié)羽毛色素沉著尤其是黑色素生成的機(jī)制仍然在很大程度上難以捉摸。因此，本研究旨在比較研究鴨黑色背羽和黑白色背羽二者黑色羽球的miRNA表達(dá)與鴨白色背羽和黑白色背羽二者白色羽球的miRNA表達(dá)，這些鴨分別是Cui Hei鴨、改鴨、純系連城鴨和一個(gè)改鴨-

2、連城鴨的F2群體。我們運(yùn)用了Solexa測(cè)序、生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)方法初步篩選了與鴨子羽毛色素沉著相關(guān)的miRNA。主要結(jié)果如下:
　　(1)利用MiRDeep2軟件鑒定了129個(gè)miRNA，其中121個(gè)與已知的雞的miRNA相近，8個(gè)為新的miRNA。另外，使用DEGseq軟件還在這兩種組織中鑒定出了五個(gè)顯著差異表達(dá)的miRNA，即miR-204-5p、miR-204-3p、miR-144-3p、miR-2188-3p和miR-13

3、0a-5p。值得注意的是，miR-204最主要在黑色羽球中表達(dá)。
　　(2)為了進(jìn)一步驗(yàn)證測(cè)序數(shù)據(jù)，完成了10個(gè)序列已鑒定的miRNA的莖環(huán)qPCR實(shí)驗(yàn)。三個(gè)miRNA（miR-204-5p、miR-30e-1-5p和miR-10b-1-5p）在黑色羽球中顯著差異表達(dá)，差異結(jié)果分別為miR-204-5p(P＜0.05)、miR-30e-1-5p(P＜0.01)和miR-10b-1-5p(P＜0.01)，而對(duì)黑色羽球和白色羽球的比較

4、發(fā)現(xiàn)miR-27-3p在白色羽球中顯著差異表達(dá)(P＜0.05)。其余六個(gè)miRNA雖然顯示出測(cè)序結(jié)果的表達(dá)模式，但并沒(méi)有顯著差異表達(dá)。
　　(3)另外，為了探索miR-204-5p的時(shí)間表達(dá)模式，通過(guò)莖環(huán)qPCR，我們?cè)诰艂€(gè)正常鴨組織，即心臟、肝臟、脾臟、腿部肌肉、肺、腎、皮膚、黑色羽球和白色羽球通過(guò)莖環(huán)qPCR進(jìn)行了組織表達(dá)譜分析。結(jié)果表明miR-204-5p在黑色羽球中的表達(dá)顯著高于白色羽球和其他七個(gè)組織。
　　(4)此

5、外，利用靶標(biāo)基因鑒定、KEGG通路和GO富集分析發(fā)現(xiàn)了潛在的靶mRNA和通路?？傆?jì)在鴨中發(fā)現(xiàn)了2324個(gè)miRNA-mRNA互作位點(diǎn)，其中2076個(gè)已注釋并有官方名稱(chēng)。黑色素生成通路確定位于已認(rèn)定的具有12個(gè)重要基因的信號(hào)通路中，因此推測(cè)這些miRNA在羽毛色素沉著中可能會(huì)發(fā)揮作用。
　　(5)同時(shí)使用qPCR實(shí)施了五個(gè)靶基因在黑色素生成通路中的表達(dá)分析。qPCR的結(jié)果表明這些基因在黑色羽球中高表達(dá)。
　　(6)我們?nèi)诤狭薽

6、iR-27-3p mimics和鴨野生型或MITF基因突變的3'非編碼區(qū)，MITF基因突變的3'非編碼區(qū)是利用XhoⅠ和NotⅠ兩種酶克隆到psiCHECK-2雙熒光素酶報(bào)告載體中，然后將其導(dǎo)入BHK細(xì)胞驗(yàn)證miR-27-3p是否能夠與推測(cè)的MITFmRNA3'UTR位點(diǎn)結(jié)合。隨后進(jìn)行了雙熒光素酶試驗(yàn)和Western blot實(shí)驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)miR-27與MITF的3'UTR（野生型）共轉(zhuǎn)染時(shí)，雙熒光素酶的活性顯著降低。Western