microRNA-33a通過靶向HIF-1α抑制黑色素瘤侵襲轉移的分子機制研究.pdf

1、研究目的:探討miR-33a/b在不同轉移潛能人皮膚黑色素瘤細胞系中的表達特點和意義。干預不同人皮膚黑色素瘤細胞系中miR-33a/b表達后，體外實驗水平觀察細胞的增殖、粘附、運動、凋亡和上皮-間質轉化等腫瘤細胞惡性生物學功能的變化。干預黑色素瘤A375細胞中miR-33a表達后，在體實驗水平觀察裸鼠皮下種植瘤的大小、體積、質量及肺臟轉移灶數目的變化情況。探討miR-33a/b影響人黑色素瘤細胞惡性生物學功能的可能機制。
　　研究

2、方法:通過real-time PCR法檢測miR-33a/b在低轉移侵襲力的皮膚黑色素瘤細胞株WM35及高轉移侵襲力的皮膚黑色素瘤細胞株WM451、A375和SK-MEL-1中的表達量。明確miR-33a/b在黑色素瘤細胞系中的表達情況，篩選miR-33a/b高表達和低表達的黑色素瘤細胞系作為進一步的實驗研究對象。構建pYr-LVX-pri-miR-33a慢毒載體，并將其包裝成慢病毒，然后感染A375細胞，建立hsa-miR-33a穩(wěn)定

3、過表達細胞系A375-pYr-LVX-pir-miR-33a;構建pYr-LVX-miR-33 a-sponge慢病毒載體，并將其包裝成慢病毒，然后分別感染WM35、WM451細胞，建立hsa-miR-33a表達抑制的穩(wěn)定細胞系WM35-pYr-LVX-miR-33 a-sponge和WM451-pYr-LVX-miR-33a-sponge。以miR-33a表達穩(wěn)定上調/抑制細胞系為研究對象，運用MTT法檢測細胞增殖能力;平板克隆形成實

4、驗檢測細胞克隆數;流式細胞術檢測細胞凋亡率;細胞劃痕實驗、Transwell實驗檢測細胞遷移侵襲力;Western Blot法檢測與EMT相關的E-鈣粘連蛋白（E-Cadherin）、N-鈣粘連蛋白(N-Cadherin)的表達情況。多層面探討miR-33a的表達對細胞增殖、細胞凋亡、侵襲轉移和EMT等表型的影響。通過皮下接種及尾靜脈注射A375及A375-pYr-LVX-pir-miR-33a細胞建立裸鼠種植瘤及移植瘤模型，觀察裸鼠皮

5、下種植瘤的大小、體積、質量及肺臟轉移灶數目的變化情況。采用生物信息學分析法預測HIF-1α可能為miR-33a的下游靶因;Western Blot法檢測miR-33a表達變化時HIF-1α蛋白的表達水平;應用雙熒光素酶基因報告法進一步驗證HIF-1α是否為miR-33a的直接靶基因。
　　研究結果:miR-33a與miR-33b在低轉移侵襲力的人皮膚黑色素瘤細胞株WM35中表達量均高，而在高轉移侵襲力的人皮膚黑色素瘤細胞株WM45

6、1、A375和SK-MEL-1中的表達量相對較低(WM35＞WM451＞A375＞SK-MEL-1);上調A375細胞株中miR-33a的表達能抑制細胞增殖、侵襲轉移和上皮-間質轉化;抑制WM451和WM35細胞株中miR-33a的表達能促進細胞增殖、侵襲轉移和上皮-間質轉化;miR-33a對細胞凋亡的影響無統計學差異。miR-33a能抑制種植瘤的形成速度，減少肺臟轉移灶的數目。生物信息學預測HIF-1α為miR-33a的下游靶基因。過

7、表達A375中miR-33a的表達后，HIF-1α的表達下降;抑制WM35、WM451中miR-33a的表達后HIF-1α的表達上升。雙熒光素酶報告實驗進一步證實HIF-1α為miR-33a的直接靶基因。
　　研究結論:miR-33a與miR-33b在低轉移侵襲力的人皮膚黑色素瘤中的表達量高于高轉移侵襲力的人皮膚黑色素瘤。miR-33a能抑制人黑色素瘤細胞株的細胞增殖、侵襲轉移，調節(jié)上皮-間質轉化過程，但不影響細胞凋亡;miR-3