人肝母細胞瘤細胞中乙肝病毒X蛋白對Cox-2表達的影響.pdf

1、背景和目的：乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染與肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)的發(fā)生密切相關，HBV感染者發(fā)生HCC的危險性是無HBV感染者的200多倍。但是，至今HBV導致肝硬化和肝癌的機制仍不十分清晰。乙肝病毒x(hepatitis B virus x protein，HBx)蛋白具有多種生物學功能，可與宿主細胞的多種蛋白相互作用，調控宿主細胞基因表達，進而影響宿主細胞的信

2、號轉導、細胞增殖與分化等，其對肝細胞周期與凋亡的影響是HBV致HCC發(fā)生的重要機制之一。HBV感染可激活多種信號通路并影響炎癥相關基因，如誘導型一氧化氮合酶(iNOS)基因，環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，Cox-2)基因和干擾素(IFN)等的表達。Cox是前列腺素(PGs)合成過程中的限速酶，可將花生四烯酸轉變?yōu)镻GH2。近年來研究發(fā)現，花生四烯酸代謝產物與腫瘤的發(fā)生有著密切的關系，HBV陽性的慢性肝炎、肝硬化和HCC

3、患者肝組織中Cox-2的表達明顯高于正常組織或癌旁正常組織，并且Cox-2與HBx蛋白促進肝癌轉移作用有關，提示Cox-2的過度表達在HBV病毒致病過程中起一定作用。本研究擬探討乙肝病毒X蛋白在人肝母細胞瘤(HepG2)細胞中對Cox-2表達的影響，并觀察對細胞生長和細胞周期的作用，為進一步闡明乙肝病毒X蛋白在HBV致病過程中的作用機制提供一些實驗依據。
　　 實驗方法：首先設計擴增HBV X蛋白的擴增引物；從HBV患者血清中P

4、CR擴增得到HBx基因；純化后與T載體(pGEM-T)連接，通用引物T7/SP6擴增鑒定克隆重組子，并進行測序分析，得到克隆重組子(pGEM-T-HBx)。BglII和EcoR I雙酶切pGEM-T-HBx，回收雙粘HBx基因片段，與表達載體pIRES2-AcGFP聯接；用BglII和EcoR I雙切鑒定亞克隆重組子pIRES2-AcGFP-HBx，并對pIRES2-AcGFP-HBx插入序列測序分析。脂質體包裹pIRES2-AcGFP

5、-HBx轉染科HepG2細胞，G418篩選獲得穩(wěn)定轉染細胞株。RT-PCR和Western-Blot檢測HBx和Cox-2 mRNA和蛋白表達情況；螢光素酶報告基因系統(tǒng)檢測HBx蛋白對Cox-2基因啟動子的作用：MTT法、流式細胞術(FCM)分別測定細胞生長和細胞周期。
　　 實驗結果：
　　 1.從HBV病人血清擴增得到465bp的HBx目的基因；T7/SP6擴增篩選得到克隆重組子(pGEM-T-HBx)；BglII和

6、EcoR I雙酶切鑒和測序證實亞克隆重組子pIRES2-AcGFP-HBx正確。
　　 2.HBx mRNA和western blot檢測結果顯示：轉染pIRES2-AcGFP-HBx的HBx蛋白表達組HepG2細胞中可見高水平的HBx mRNA和蛋白表達，HBx基因轉染篩選成功。
　　 3.HBx蛋白表達組(轉染pIRES2-AcGFP-HBx的HepG2細胞)細胞Cox-2 mRNA的相對表達量為0.76±0.12，

7、載體對照組(轉染pIRES2-AcGFP的HepG2細胞)的相對表達量為0.28±0.04、空白對照組(未轉染的HepG2細胞)的相對表達量為0.25±0.03；經統(tǒng)計學分析，HBx蛋白表達組細胞Cox-2mRNA的相對表達量顯著高于載體對照組和空白對照組，差異有非常顯著性(P<0.01)。
　　 4.Cox-2蛋白免疫印跡結果顯示：有HBx蛋白表達的HepG2細胞中Cox-2蛋白表達顯著升高。
　　 5.HBx蛋白表達

8、組細胞Cox-2啟動子螢光素酶熒光度值為1675.2±84.9，載體對照組的熒光度值為657.7±34.7、空白對照組的熒光度值為739.3±45.3；經統(tǒng)計學分析HBx蛋白表達組細胞Cox-2啟動子螢光素酶熒光度值顯著高于載體對照組和空白對照組，差異有顯著性(P<0.05)。
　　 6.HBx蛋白表達組細胞在3d、4d、5d生長顯著加快，與載體對照組和空白對照組細胞MTT測定結果比較差異均有顯著性(P<0.05)。
　　

9、 7.載體對照組與空載體對照組之間G0～G1期、G2～M期、S期比例，經統(tǒng)計學處理差異無顯著性(P>0.05)。而HBx蛋白表達組與2個對照組比較，G0～G1期比例顯著降低，S期和G2～M期比例顯著增加，差性有顯著性(P<0.05)。
　　 結論：在HepG2細胞中，HBx蛋白對Cox-2啟動子活性有顯著提高作用，HBx蛋白可顯著升高細胞中Cox-2蛋白表達水平：HBx蛋白可促進HepG2細胞分裂增殖、促進細胞生長。