microRNA干擾RORα表達對DADS誘導人胃癌細胞增殖與周期的影響.pdf

1、目的：維甲酸相關孤核受體α（Retinoid acid receptor related Orphan Receptorα，RORα）可能參與多種腫瘤的調控。二烯丙基二硫（diallyl disulfide, DADS）可誘導人胃癌細胞增殖抑制、分化與細胞周期G2/M期阻滯，其機制可能與RORα蛋白表達上調有關，但其具體機制不明，因此本研究通過microRNA干擾技術將RORα基因沉默，觀察其對DADS誘導的增殖抑制與周期阻滯的影響，探

2、討DADS抑制人胃癌細胞作用的分子機制。
　　方法:
　　1.根據 GenBank提供的RORα基因序列設計4條 RNA干擾序列，命名為miRNA1、miRNA2、miRNA3、miRNA4，并設計1條非特異性序列作為陰性對照。合成各自的寡核苷酸鏈，退火后與 miRNA表達載體 pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR連接，轉化擴增后測序，將含靶向RORα的miRNA的質粒pcDNATM6.2-GW/EmGFpmiR-R

3、ORα轉染SGC7901， MGC803細胞，建立穩(wěn)轉細胞系，通過Western blot驗證miRNA-RORα對RORα表達的抑制作用；
　　2.細胞計數、MTT法和流式細胞術分析RORα表達下調對DADS誘導胃癌細胞增殖與周期的影響。
　　結果:
　　1.重組pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-RORα-miRNA質粒經單酶切與DNA測序分析證明重組載體構建成功，熒光顯微鏡下觀察可見轉染細胞內的綠色熒光

4、。Western blot結果顯示，與未轉染組相比，轉染RORα-miRNA后使人胃癌SGC7901、MGC803細胞內RORα蛋白表達均明顯降低（P<0.05）。
　　2.細胞計數結果顯示，與未轉染組比較，RORα-miRNA轉染組細胞增殖率增加，且群體倍增時間縮短(P<0.05)，說明抑制RORα基因表達促進了SGC7901、MGC803細胞增殖。而陰性轉染組增殖率、群體倍增時間無明顯改變（P>0.05）。DADS處理后，各組

5、細胞群體倍增時間均延長，細胞增殖被抑制，但miRNA干擾 RORα表達后的兩組細胞經DADS處理后，其細胞群體倍增時間延長幅度明顯低于DADS處理的未轉染組(P<0.05)，說明抑制 RORα表達削弱了DADS誘導的增殖抑制作用。
　　3. MTT結果顯示，RORα-miRNA轉染可使SGC7901、MGC803細胞的增殖率（光吸收值）明顯高于未轉染組(P<0.05)，說明干擾 RORα表達可促進細胞增殖。而陰性轉染組增殖率無明顯

6、改變（P>0.05）。分別加入15mg·L-1、30mg·L-1 DADS24h后，RORα-miRNA3轉染的SGC7901、MGC803細胞的增殖抑制率分別為27.14％、33.48%，均明顯低于DADS處理的未轉染組36.15%、45.35%(P<0.05)，48h、72h和96h后也是一樣的結果，提示干擾RORα表達削弱了DADS的抑制增殖作用。
　　4.流式細胞術發(fā)現，與未轉染組比較，轉染RORα-miR3后SGC790

7、1、MGC803細胞周期中G0/G1期細胞百分比明顯降低，而S期和G2/M期細胞百分比增高（P<0.05），且增殖指數也增高（P<0.05），說明干擾RORα表達后有促進細胞增殖作用，而陰性轉染組各期百分比、增殖指數無明顯改變（P>0.05）。15mg·L-1、30mg·L-1 DADS分別處理RORα-miR3轉染組SGC7901、MGC803細胞24h后，G2/M期百分率均明顯低于DADS處理的未轉染組（P<0.05），表明干擾RO

8、Rα表達可削弱DADS對SGC7901、MGC803細胞的G2/M期阻滯作用。
　　結論:
　　1. miR-RORα表達載體(pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-RORα)轉染細胞后可明顯抑制人胃癌SGC7901、MGC803細胞中RORα表達。
　　2. microRNA抑制RORα表達后，可促進人胃癌SGC7901、MGC803細胞增殖，并且削弱DADS的增殖抑制及G2/M期阻滯作用，說明RORα表達上