M膽堿能受體對(duì)脊髓Ⅱ板層甘氨酸能神經(jīng)元沖動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分Oxo-M對(duì)正常大鼠脊髓Ⅱ板層甘氨酸能sIPSCs和mIPSCs的影響 目的:探討正常大鼠中Oxo-M對(duì)脊髓Ⅱ板層甘氨酸能神經(jīng)元sIPSCs和mIPSCs的影響。 方法:采用全細(xì)胞電壓鉗記錄技術(shù)，在鉗制電壓為0mV時(shí)，給予20μMCNQX以阻斷非NMDA受體，10μM荷包牡丹堿以阻斷GABAA受體電流，記錄甘氨酸能sIPSCs；另外再給予1μM河豚毒素(TTX)以阻斷動(dòng)作電位引起的遞質(zhì)釋放，可以記錄到甘氨酸能的微

2、小抑制性突觸后電流(mIPSCs)。觀察1、3、5、10μM的Oxo-M對(duì)甘氨酸能神經(jīng)元sIPSCs和mIPSCs頻率和波幅的影響。 結(jié)果:在所有記錄的22個(gè)神經(jīng)元中，其中16個(gè)神經(jīng)元對(duì)Oxo-M產(chǎn)生明顯的反應(yīng)(72.73％)，3～5μM的Oxo-M可明顯增加甘氨酸能神經(jīng)元sIPSCs的頻率而不改變其波幅。與3μMOxo-M的效應(yīng)相比，10μM的Oxo-M對(duì)甘氨酸能sIPSCs頻率的增強(qiáng)幅度卻有所減弱。而6個(gè)細(xì)胞對(duì)1～10μM的

3、Oxo-M沒有產(chǎn)生任何反應(yīng)(27.27％)。記錄的sIPSCs可完全被2μM士可寧所去除，Oxo-M的對(duì)甘氨酸能sIPSCs的作用可完全被2μM阿托品所阻斷。另外記錄的9個(gè)神經(jīng)元中，1、3、5、10μM的Oxo-M對(duì)甘氨酸能神經(jīng)元mIPSCs的頻率和波幅均沒有產(chǎn)生明顯影響。 結(jié)論:激活位于脊髓Ⅱ板層甘氨酸能神經(jīng)元胞體上的膽堿能受體可增加甘氨酸能神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，但作用方式不是劑量依賴性。 第二部分Oxo-M對(duì)百日咳毒素(P

4、TX)處理大鼠脊髓Ⅱ板層甘氨酸能sIPSCs和mIPSCs的影響 目的:探討百日咳毒素(PTX)處理大鼠中Oxo-M對(duì)脊髓Ⅱ板層甘氨酸能神經(jīng)元sIPSCs和mIPSCs的影響。 方法:記錄方法同實(shí)驗(yàn)1。在電生理記錄前5～7天，取SD雄性大鼠10只，160～180克，分成2組，每組5只。在吸入全麻下行鞘內(nèi)置管術(shù)，鞘內(nèi)給予1μg和2μg兩個(gè)劑量的百日咳毒素以滅火Gi/o蛋白。 結(jié)果:在PTX2μg處理組大鼠脊髓中，共

5、記錄15個(gè)Ⅱ板層神經(jīng)元，3～10μMOxo-M均以濃度依賴方式明顯增加甘氨酸神經(jīng)元sIPSCs的頻率而未改變其波幅。在另外記錄的8個(gè)神經(jīng)元中，3μMOxo-M初始引起sIPSCs的頻率的顯著增加，當(dāng)完全洗脫掉Oxo-M藥物作用后再給予1μM的TTX，3μMOxo-M對(duì)所有8個(gè)細(xì)胞mIPSCs的頻率和波幅均未產(chǎn)生明顯的影響。而在PTX1μg處理組大鼠中，記錄的10個(gè)脊髓Ⅱ板層神經(jīng)元對(duì)Oxo-M產(chǎn)生的效應(yīng)與PTX2μg處理組相似，兩者之間相

6、比無明顯差異(p＞0.05)。 結(jié)論:用PTX滅活Gi/o蛋白可增加高濃度Oxo-M對(duì)甘氨酸能sIPSCs的增強(qiáng)效應(yīng)，這種作用與Gi/o蛋白相耦聯(lián)的受體有關(guān)。 第三部分GABAB受體對(duì)Oxo-M誘導(dǎo)的甘氨酸能sIPSCs的影響 目的:探討GABAB受體對(duì)Oxo-M誘導(dǎo)的甘氨酸能sIPSCs的影響，并進(jìn)一步探討GABAB受體是否參與高濃度Oxo-M誘導(dǎo)的甘氨酸釋放幅度降低的效應(yīng)。 方法:記錄方法同實(shí)驗(yàn)1。鉗

7、制電壓為0mV，灌流液中持續(xù)應(yīng)用1μMCGP55845(GABAB受體特異性阻斷劑)以阻斷GABAB受體，然后觀察1、3、5、10μM的Oxo-M對(duì)脊髓Ⅱ板層甘氨酸能sIPSCs的影響。 結(jié)果:記錄13個(gè)神經(jīng)元，3～10μMOxo-M均明顯增加甘氨酸能sIPSCs的頻率。值得注意的是，Oxo-M對(duì)甘氨酸能sIPSCs的作用在3μM時(shí)達(dá)到最大，這種作用可持續(xù)到5～10μM。而3、5、10μM三種濃度間相比，Oxo-M對(duì)sIPSCs

8、的頻率的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。 結(jié)論:3μM的Oxo-M引起甘氨酸遞質(zhì)的最大釋放，而Oxo-M這種最大刺激作用可持續(xù)到10μM。因此突觸前的GABAB受體參與了高濃度Oxo-M誘導(dǎo)的甘氨酸遞質(zhì)釋放。 第四部分M2和M4膽堿能受體亞型在Oxo-M誘導(dǎo)的甘氨酸能sIPSCs增強(qiáng)效應(yīng)的作用 目的:進(jìn)一步確定M2和/或M4膽堿能受體亞型在Oxo-M誘導(dǎo)的脊髓Ⅱ板層甘氨酸能sIPSCs增強(qiáng)效應(yīng)中的作用

9、方法:記錄方法同實(shí)驗(yàn)1。實(shí)驗(yàn)分為兩部分：第一部分記錄的Ⅱ板層細(xì)胞分為2組：(1)一組灌流液中持續(xù)給予10μMAFDX-116(M2受體阻斷劑)，觀察M2受體亞型的作用；(2)另外一組灌流液中持續(xù)給予1μMHimbacine(M2和M4受體阻斷劑)，觀察M4受體亞型的作用。鉗制電壓為OmV時(shí)，記錄1、3、5、10μMOxo-M對(duì)脊髓Ⅱ板層甘氨酸能sIPSCs的影響。第二部分在灌流液中持續(xù)應(yīng)用1μMCGP-55845以阻斷GABAB受體，然

10、后給予5μM的Oxo-M，記錄增加的脊髓Ⅱ板層甘氨酸能sIPSCs頻率，完全洗脫Oxo-M的藥物作用后，記錄細(xì)胞分為兩組：(1)一組給予10μMAFDX-116；(2)另外一組的神經(jīng)元中應(yīng)用1μMHimbacine。加用10μMAFDX-116或1μMHimbacine3～5min同時(shí)，再第二次給予5μMOxo-M，記錄脊髓Ⅱ板層甘氨酸能神經(jīng)元的sIPSCs頻率。 結(jié)果:在第一部分中：給予AFDX-16組，共記錄15個(gè)神經(jīng)元，3

11、～10μMOxo-M以濃度依賴方式明顯增加甘氨酸能sIPSCs的頻率；而在給予Himbacine組的17個(gè)神經(jīng)元中，3～10μMOxo-M產(chǎn)生了與AFDX-116組神經(jīng)元相似的作用。在第二部分中：在預(yù)先給予1μMCGP-55845阻斷GABAB受體后，在給予AFDX-116組，共記錄16個(gè)神經(jīng)元，5μMOxo-M明顯增加甘氨酸能sIPSCs的頻率，單獨(dú)給予10μMAFDX-116并不能顯著影響甘氨酸能sIPSCs的頻率，但能明顯減少5μ

12、MOxo-M誘導(dǎo)的甘氨酸能sIPSCs增強(qiáng)作用的幅度；在給予Himbacine組的15個(gè)神經(jīng)元中，1μMHimbacine也明顯減少5μMOxo-M誘導(dǎo)的甘氨酸能sIPSCs的增強(qiáng)作用幅度，但AFDX-116和Himbacine兩組相比無明顯差異(p＜0.05)。 結(jié)論:M2和M4膽堿能受體亞型參與了高濃度Oxo-M誘導(dǎo)的甘氨酸遞質(zhì)釋放過程。當(dāng)去除GABAB受體的突觸前抑制作用后，刺激位于甘氨酸能神經(jīng)元上的M2膽堿能受體亞型，可

13、刺激脊髓Ⅱ板層神經(jīng)元的甘氨酸遞質(zhì)釋放，M4的作用并不明顯。 第五部分M3受體亞型在Oxo-M誘導(dǎo)的甘氨酸能sIPSCs增強(qiáng)效應(yīng)中的作用 目的:探討M膽堿能受體亞型在Oxo-M誘導(dǎo)的脊髓Ⅱ板層甘氨酸能sIPSCs增強(qiáng)效應(yīng)中的作用。 方法:記錄方法同實(shí)驗(yàn)1。記錄的Ⅱ板層神經(jīng)細(xì)胞分為2組：(1)正常大鼠組(2)PTX處理大鼠組。PTX大鼠處理方法同實(shí)驗(yàn)2。灌流液中給予25nM4-DAMP-選擇性M3受體亞型的阻斷劑，確

14、定脊髓Ⅱ板層中間神經(jīng)元上的M3受體亞型是否參與調(diào)節(jié)Oxo-M誘導(dǎo)的甘氨酸能sIPSCs增強(qiáng)效應(yīng)。記錄3μMOxo-M增加的甘氨酸能sIPSCs，Oxo-M作用完全洗脫后，再同時(shí)給予25nM4-DAMP和3μM的Oxo-M，記錄脊髓Ⅱ板層甘氨酸能sIPSCs的變化。 結(jié)果:記錄正常組大鼠的9個(gè)神經(jīng)元，PTX處理組大鼠8個(gè)脊髓Ⅱ板層神經(jīng)元。在兩組神經(jīng)元中，3μMOxo-M均明顯增加甘氨酸能sIPSCs的頻率，而25nM4-DAMP可