二氮嗪、環(huán)孢菌素A拮抗Aβ-,1-42-致膽堿能神經(jīng)元凋亡的研究.pdf

1、阿爾茨海默病（AD）是老年人常見的神經(jīng)細(xì)胞退行性變疾病，AD中較為肯定的病理變化是基底前腦膽堿能神經(jīng)元的選擇性減少，其特征性表現(xiàn)是細(xì)胞外大量的β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉積形成的老年斑（SP）。在SP形成過程中有大量的Ap沉積，其核心成分是淀粉樣前體蛋白（APP）水解產(chǎn)生的40～43個(gè)氨基酸殘基組成的，主要以兩種形式存在，即Aβ1-40和Aβ1-42。最近研究表明，β-淀粉樣蛋白的在AD發(fā)病過程中起了重要的作用，雖然其具體作用機(jī)制仍不明確，

2、但Aβ的細(xì)胞毒性尤其是Aβ的致神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用一直倍受研究者的關(guān)注。體外研究表明，AD發(fā)生時(shí)Aβ引起線粒體能量生成障礙并誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量的反應(yīng)性活性氧（ROS），致使細(xì)胞內(nèi)Na+/K+ATP酶活性降低，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。 ATP敏感性鉀通道（KATP）是存在于細(xì)胞膜與線粒體內(nèi)膜（MitOKATP）上具有多種作用的通道。有研究證實(shí)激活MitoKATP通道多種損傷因素導(dǎo)致的細(xì)胞損傷與凋亡具有保護(hù)作用。免疫抑制劑環(huán)孢菌素A是線粒體滲透性

3、轉(zhuǎn)換孔開放抑制劑，能夠特異性的拮抗多種損傷刺激對(duì)線粒體膜滲透性轉(zhuǎn)換孔的開放作用，抑制線粒體膜滲透性轉(zhuǎn)換孔的開放而發(fā)揮保護(hù)作用。有研究表明，環(huán)孢菌素A對(duì)細(xì)胞缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。 目前研究發(fā)現(xiàn)線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔和MitoKATP通道對(duì)多種損傷因素導(dǎo)致的細(xì)胞損傷與凋亡具有調(diào)節(jié)作用，試通過調(diào)節(jié)線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔和MitoKATP來研究其在老年癡呆體外神經(jīng)元凋亡模型中的作用。 目的:研究β-淀粉樣蛋白（Aβ1-42）對(duì)原代

4、培養(yǎng)線大鼠基底前腦膽堿能神經(jīng)元凋亡作用并利用粒體ATP敏感性鉀離子通道（MitoKATP）開放劑二氮嗪與環(huán)孢菌素A及二者協(xié)同對(duì)干預(yù)，以探討其對(duì)Aβ1-42致膽堿能神經(jīng)元凋亡的影響。 方法: ①運(yùn)用細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法培養(yǎng)大鼠基底前腦膽堿能神經(jīng)元，采用膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行鑒定。 ②利用2μmol/L（終濃度）的Aβ1-42對(duì)原代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)建立AD細(xì)胞凋亡模型，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞隨機(jī)分為3個(gè)組：對(duì)照組

5、、Aβ42-1處理組和Aβ1-42處理組，作用不同時(shí)間（24h、72h）后置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，四唑鹽（MTT）比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率。 ③利用500μmol/L二氮嗪（預(yù)處理1h）、20μmol/L環(huán)孢菌素A以及二者協(xié)同對(duì)其干預(yù)，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞隨機(jī)分為5個(gè)組：A組：空白對(duì)照組：B組：Aβ1-42干預(yù)組；C組：Aβ1-42+二氮嗪預(yù)處理干預(yù)組：D組：Aβ1-42+環(huán)孢菌素A干預(yù)組；E組：Aβ1-42+二氮嗪預(yù)處理+環(huán)孢菌素A干預(yù)

6、組。作用不同時(shí)間（24h、72h）后置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，四唑鹽（MTT）比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率和Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素C、Caspase-3及Cleaved Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平變化。 結(jié)果: ①原代培養(yǎng)大鼠基底前腦神經(jīng)元，于體外培養(yǎng)第7d進(jìn)行膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶ChAT免疫細(xì)胞化學(xué)染色，結(jié)果顯示，90％以上為ChAT陽性神經(jīng)元。 ②作用72h后細(xì)胞

7、形態(tài)發(fā)生明顯損傷性變化，細(xì)胞存活率明顯降低，Bcl-2表達(dá)量降低，細(xì)胞色素C、Caspase-3及Cleaved Caspase-3的表達(dá)量增加，Bax未見明顯變化，Bcl-2/Bax比值降低。 ③500μmol/L二氮嗪（預(yù)處理1h）、20μmol/L環(huán)孢菌素A以及二者協(xié)同對(duì)AD神經(jīng)元凋亡模型干預(yù)，作用24h后Bcl-2的表達(dá)即增加，作用72小時(shí)能明顯增加Bcl-2的表達(dá)及提升Bc-2/Bax比率而抑制細(xì)胞色素C、Caspas