二氮嗪、環(huán)孢菌素A拮抗Aβ-,1-42-致膽堿能神經(jīng)元凋亡的研究.pdf

1、阿爾茨海默?。ˋD）是老年人常見的神經(jīng)細胞退行性變疾病，AD中較為肯定的病理變化是基底前腦膽堿能神經(jīng)元的選擇性減少，其特征性表現(xiàn)是細胞外大量的β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉積形成的老年斑（SP）。在SP形成過程中有大量的Ap沉積，其核心成分是淀粉樣前體蛋白（APP）水解產(chǎn)生的40～43個氨基酸殘基組成的，主要以兩種形式存在，即Aβ1-40和Aβ1-42。最近研究表明，β-淀粉樣蛋白的在AD發(fā)病過程中起了重要的作用，雖然其具體作用機制仍不明確，

2、但Aβ的細胞毒性尤其是Aβ的致神經(jīng)細胞凋亡作用一直倍受研究者的關注。體外研究表明，AD發(fā)生時Aβ引起線粒體能量生成障礙并誘導細胞產(chǎn)生大量的反應性活性氧（ROS），致使細胞內Na+/K+ATP酶活性降低，導致細胞凋亡。 ATP敏感性鉀通道（KATP）是存在于細胞膜與線粒體內膜（MitOKATP）上具有多種作用的通道。有研究證實激活MitoKATP通道多種損傷因素導致的細胞損傷與凋亡具有保護作用。免疫抑制劑環(huán)孢菌素A是線粒體滲透性

3、轉換孔開放抑制劑，能夠特異性的拮抗多種損傷刺激對線粒體膜滲透性轉換孔的開放作用，抑制線粒體膜滲透性轉換孔的開放而發(fā)揮保護作用。有研究表明，環(huán)孢菌素A對細胞缺血再灌注損傷具有保護作用。 目前研究發(fā)現(xiàn)線粒體滲透性轉換孔和MitoKATP通道對多種損傷因素導致的細胞損傷與凋亡具有調節(jié)作用，試通過調節(jié)線粒體滲透性轉換孔和MitoKATP來研究其在老年癡呆體外神經(jīng)元凋亡模型中的作用。 目的:研究β-淀粉樣蛋白（Aβ1-42）對原代

4、培養(yǎng)線大鼠基底前腦膽堿能神經(jīng)元凋亡作用并利用粒體ATP敏感性鉀離子通道（MitoKATP）開放劑二氮嗪與環(huán)孢菌素A及二者協(xié)同對干預，以探討其對Aβ1-42致膽堿能神經(jīng)元凋亡的影響。 方法: ①運用細胞原代培養(yǎng)的方法培養(yǎng)大鼠基底前腦膽堿能神經(jīng)元，采用膽堿乙酰轉移酶（ChAT）免疫細胞化學進行鑒定。 ②利用2μmol/L（終濃度）的Aβ1-42對原代培養(yǎng)細胞進行干預建立AD細胞凋亡模型，實驗細胞隨機分為3個組：對照組

5、、Aβ42-1處理組和Aβ1-42處理組，作用不同時間（24h、72h）后置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，四唑鹽（MTT）比色法檢測細胞存活率。 ③利用500μmol/L二氮嗪（預處理1h）、20μmol/L環(huán)孢菌素A以及二者協(xié)同對其干預，實驗細胞隨機分為5個組：A組：空白對照組：B組：Aβ1-42干預組；C組：Aβ1-42+二氮嗪預處理干預組：D組：Aβ1-42+環(huán)孢菌素A干預組；E組：Aβ1-42+二氮嗪預處理+環(huán)孢菌素A干預

6、組。作用不同時間（24h、72h）后置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，四唑鹽（MTT）比色法檢測細胞存活率和Western blot檢測細胞內Bcl-2、Bax、細胞色素C、Caspase-3及Cleaved Caspase-3等凋亡相關蛋白的表達水平變化。 結果: ①原代培養(yǎng)大鼠基底前腦神經(jīng)元，于體外培養(yǎng)第7d進行膽堿乙酰轉移酶ChAT免疫細胞化學染色，結果顯示，90％以上為ChAT陽性神經(jīng)元。 ②作用72h后細胞

7、形態(tài)發(fā)生明顯損傷性變化，細胞存活率明顯降低，Bcl-2表達量降低，細胞色素C、Caspase-3及Cleaved Caspase-3的表達量增加，Bax未見明顯變化，Bcl-2/Bax比值降低。 ③500μmol/L二氮嗪（預處理1h）、20μmol/L環(huán)孢菌素A以及二者協(xié)同對AD神經(jīng)元凋亡模型干預，作用24h后Bcl-2的表達即增加，作用72小時能明顯增加Bcl-2的表達及提升Bc-2/Bax比率而抑制細胞色素C、Caspas