生長因子誘導骨髓基質(zhì)干細胞向膽堿能神經(jīng)元分化及其信號轉(zhuǎn)導機制研究.pdf

1、近年來，對骨髓基質(zhì)干細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)可塑性的研究進展迅速，BMSCs能夠分化形成包括造血組織在內(nèi)的多種組織細胞，特別是中胚層和神經(jīng)外胚層來源的組織細胞，如骨、軟骨、脂肪、纖維組織、上皮組織和骨髓支持基質(zhì)等多種間充質(zhì)組織，使人們看到了用細胞移植方法治療神經(jīng)退行性疾病的新希望。
　　 2000年Brazelton和Mezey異體移植BMSCs成功，其后才證明BMSCs可向神經(jīng)細胞

2、分化，近年來對BMSCs的促分化因子進行了大量的研究，β—巰基乙醇(beta—mercaptoethanol，BME)、二甲基亞砜(dimethylsul foxide，DMSO)、4—羥基茴香醚(butylatedhydroxyanisole，BHA)、五氮雜胞苷(5—azacytidine)、維甲酸(retinoicacid，RA)等相繼被證實可以誘導BMSCs分化為神經(jīng)元樣細胞。一些生長因子如表皮生長因子(epidermalgro

3、wthfactor，EGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brainderivedneurotrophicfactor，BDNF)，和視黃酸、胎鼠中腦或紋狀體細胞懸液共同作用后，在體外也成功誘導成年大鼠和人的BMSCs分化為幼稚的神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞。BMSCs還可被誘導分化為特征類型的神經(jīng)元，如5—HT敏感神經(jīng)元，多巴胺能神經(jīng)元，但膽堿能神經(jīng)元的分化一直是個難題。
　　 BMSCs分化為神經(jīng)細胞的機制十分復雜，除了表達中胚層mRNA以外，

4、還表達生殖細胞以及內(nèi)、外胚層基因。其向神經(jīng)元的分化受神經(jīng)特異性基因表達量的調(diào)控，而并非由相應基因表達的開放與關閉控制。Sox、Pax、Notch、delta、frizzled、erbB基因以及RB、RB2/P130基因在BMSCs分化中起重要作用，最新研究表明其分化和MAPK信號通路有關。
　　 雖然有關BMSCs分化為神經(jīng)元的研究進展迅速，但仍有很多問題未得到解決：首先，誘導骨髓基質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)元的方案中，都存在一些缺陷，

5、如由于化學誘導劑的毒性而不適合臨床應用，某些生長因子雖然能誘導分化，但不能定向分化為特定類型等。雖然誘導BMSCs分化為多巴胺能神經(jīng)元和5—HT敏感神經(jīng)元已經(jīng)成功，但向膽堿能神經(jīng)元的分化至今未見報道。其次，誘導分化的機理研究尚不充分，尤其是分化信號的轉(zhuǎn)導過程不明。以往的研究提示，在不同的細胞類型中，同一個信號傳遞過程可能表現(xiàn)出截然相反的結(jié)果，尤其是PI3K—Akt—mTOR通路和MAPK通路在BMSCs向神經(jīng)元分化過程中的作用，僅見兩篇

6、報道。另外，細胞分化過程涉及到結(jié)構(gòu)重建、細胞器重組、凋亡和自噬等復雜的過程，但與BMSCs向神經(jīng)分化相關的自噬研究尚屬空白，針對上述問題，本課題開展了一系列的研究。
　　 研究目的：
　　 篩選建立生長因子體外誘導BMSCs分化為膽堿能神經(jīng)元的有效方法；通過采用特異性抑制劑，觀察生長因子誘導BMSCs向膽堿能神經(jīng)元分化的分化率和生存率的變化；通過檢測PI3K—Akt—mTOR通路和MAPK通路蛋白以及p53表達和自噬水平

7、的改變，初步闡明生長因子誘導BMSCs分化的信號轉(zhuǎn)導機制。
　　 研究方法：
　　 (1)建立BMSCs培養(yǎng)和擴增方法，用不同濃度NGF誘導BMSCs分化，光鏡觀察分化細胞情況，從中篩選出合適的濃度；用NGF、NGF+bFGF和NGF+EGF+bFGF三種處理方式誘導BMSCs，光鏡觀察分化情況，免疫熒光鑒定MAP—2表達，以篩選有效組合；(2)用LY294002抑制PI3K活性，光鏡觀察其對生長因子誘導分化的影響，免疫

8、熒光鑒定MAP—2和ChAT表達并計算ChAT陽性細胞率，MTT法測定分化細胞死亡率；(3)Westernblot檢測生長因子單獨誘導、LY294002單獨作用和兩者共同作用時Akt、ERK激活的變化，p53表達量的變化，以及Cathepsin—B、LC3檢測自噬水平，結(jié)合ChAT陽性細胞率，細胞生存率的結(jié)果，分析誘導分化的信號傳導機制。
　　 實驗結(jié)果：
　　 (1)NGF100ng/mL有很好的誘導分化作用，NGF+

9、EGF+bFGF聯(lián)合應用能誘導BMSCs分化為ChAT陽性神經(jīng)細胞，分化率達60～70％。ChAT陽性細胞率有一定的時間相關性，誘導后3h、5h明顯高于1h，但3h后陽性率不再升高(P＞0.05，與5h相比)；單純抑制PI3K(LY294002組)也能誘導BMSCs分化為ChAT陽性細胞，然而其陽性細胞率在每一個時間點都明顯低于生長因子誘導組；在生長因子與LY294002聯(lián)合處理組，ChAT陽性細胞率明顯高于單純生長因子組。
　　

10、 (2)生長因子誘導BMSCs分化為ChAT陽性神經(jīng)元后，隨著時間延長細胞生存率并無明顯下降，PI3K抑制使分化細胞大量死亡，生存率降低，并明顯抑制生長因子誘導BMSCs分化的膽堿能神經(jīng)元的生存率。
　　 (3)生長因子誘導BMSCs分化后，Akt磷酸化蛋白顯著增多并持續(xù)至5h：抑制PI3K活性后，Akt有一定的磷酸化激活，但5h后顯著下降，與對照組相比已無差別。LY294002阻斷PI3K活性后，生長因子對Akt的磷酸化水平

11、在處理后1h沒有明顯改變，3h后磷酸化水平明顯增高，至5h后仍然維持在高水平。
　　 (4)生長因子誘導后1hERK1/2明顯激活，顯著高于對照組，3h和5h后明顯下降，PI3K抑制可明顯阻滯ERK1/2的激活，但與生長因子聯(lián)合作用后1h，可增加ERK1/2的水平，3h、5h則明顯低于未抑制組。
　　 (5)生長因子誘導分化后，p53表達上調(diào)，PI3K抑制后p53表達量進一步增加，同時生長因子可明顯降低BMSCs誘導分化

12、后的自噬水平，并與PI3K抑制有協(xié)同作用。
　　 結(jié)論：
　　 1．首次發(fā)現(xiàn)NGF、EGF和bFGF聯(lián)合處理可有效誘導BMSCs分化為ChAT陽性的膽堿能神經(jīng)元。
　　 2．生長因子通過激活Akt誘導BMSCs分化為膽堿能神經(jīng)元，Akt激活需至一定水平才能誘導分化，存在一個“誘導閾值”。
　　 3．ERK1/2的激活是分化細胞生存的重要條件之一，高度激活的Akt誘導信號可引起ERK1/2的激活抑制，從而降