黃麻再生遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化及UGPase、CesA1、CCoAOMT基因克隆與功能鑒定.pdf

1、黃麻（Corchorus capsularisL.），又稱綠麻，為椴樹科黃麻屬一年生草本韌皮纖維作物，是世界上最重要的長纖維作物之一，產(chǎn)量和種植面積僅次于棉花。由于黃麻纖維產(chǎn)量高、有光澤、吸濕性能好、散水快、易降解、質(zhì)地柔軟的特點，在商業(yè)上有金色纖維之稱。近年來隨著育種家的不斷努力，黃麻纖維產(chǎn)量有了大幅度的提高，但由于黃麻中纖維素總體含量較低和木質(zhì)素含量較高，導(dǎo)致黃麻韌皮纖維細胞壁木質(zhì)化、單纖維細胞較短、粗硬、彈性小、可紡支數(shù)低等，嚴重

2、影響黃麻纖維在面料紡織品上的有效應(yīng)用和經(jīng)濟效益。
　　植物組織培養(yǎng)是基因工程操作的重要基礎(chǔ)，在大部分植物中，愈傷組織是實現(xiàn)農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的直接受體，同時也是獲取原生質(zhì)體、體細胞雜交、植株再生等的重要基礎(chǔ)。目前有關(guān)黃麻組織培養(yǎng)和再生體系的研究較少，這嚴重制約著黃麻基因工程的發(fā)展。
　　本研究主要研究內(nèi)容為：利用不同公司的RNA提取試劑盒和和提取方法，優(yōu)化了高質(zhì)量黃麻RNA提取方法；利用優(yōu)化的快速獲取基因5’端的技術(shù)體系，獲

3、得了黃麻纖維素合成相關(guān)基因UGPase、CesA1和CCoAOMT基因cDNA片段并對該基因進行了功能鑒定；利用不同培養(yǎng)基和激素配比，研究了黃麻組織培養(yǎng)再生體系；利用韌皮部特異啟動子定向沉默黃麻CCoAOMT基因。最后利用所獲得的UGPase基因轉(zhuǎn)化黃麻，來研究利用UGPase和CCoAOMT基因改良黃麻品質(zhì)的可行性，主要研究結(jié)果如下：
　　1.1黃麻組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化
　　以圓果種黃麻“黃麻179”為材料，確定了

4、以子葉和幼莖為外植體產(chǎn)生愈傷組織最佳培養(yǎng)基分別為：MS培養(yǎng)基中添加0.5mg/L TDZ+0.1mg/L或0.5mg/L IAA,MS培養(yǎng)基中添加2.0mg/L6-BA+0.5mg/L IAA和MS培養(yǎng)基中添加0.25mg/L TDZ+0.1mg/L或0.5mg/L NAA,MS培養(yǎng)基中添加0.5mg/L6-BA+0.5mg/L NAA。子葉愈傷組織再分化培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/L NAA，幼莖愈傷組織再分化培

5、養(yǎng)基為MS+0.5mg/L TDZ+2.0mg/L IAA，通過篩選不同種類的褐變抑制劑，最終確定以0.1％的植酸作為黃麻組培中褐變抑制劑效果較好，不定芽誘導(dǎo)中，最終確定子葉節(jié)不定芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基是 MS+2.0mg/L6-BA+0.25mg/L NAA+100 mg/L HC。誘導(dǎo)率達到36.4%，不定芽或苗根誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L6-BA+1mg/L NAA。選用200mg/LCef作為子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化的抑制農(nóng)桿菌生長的

6、抑制劑，20mg/L的潮霉素作為轉(zhuǎn)化后子葉節(jié)的篩選臨界濃度，最后采用新鮮外植體，菌液中添加100μM的乙酰丁香通，濃度調(diào)整為OD值為0.5，侵染時間為10min，獲得的GUS染色率較高，所有GUS染色過的植株經(jīng)過PCR反應(yīng)均能擴增出目的條帶。研究結(jié)果為今后黃麻基因工程育種提供了重要的途徑。
　　1.2黃麻尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGPase)基因克隆與功能鑒定
　　成功分離了黃麻尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGP

7、ase),暫命名為CcUGPase1，該基因cDNA全長1,395bp，編碼465個氨基酸，編碼蛋白的分質(zhì)量51.15619kD,理論等電點是6.11，CcUGPase生物信息學(xué)分析表明，該基因?qū)儆谔腔D(zhuǎn)移酶家族成員，RT-PCR分析表明，該基因在根、莖皮、葉中均有表達，其表達量為莖皮>根>葉,在40天和120天時期表達較高，在擬南芥中過量表達CcUGPase1基因表明，轉(zhuǎn)基因植株生長速率加快、高度增加，纖維素含量比對照增加(8%-17

8、%)，木質(zhì)素含量和節(jié)間距沒有明顯變化。表明該基因在植物的生長發(fā)育和纖維素代謝過程中起重要的調(diào)控作用。
　　1.3黃麻纖維素合成酶基因(CcCesA1)克隆與功能鑒定
　　克隆黃麻纖維素合成酶CcCesA1基因除5'端500 bp序列外的全部cDNA。其序列長度為2529 bp，編碼627氨基酸殘基，經(jīng)Blast基因比對和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，確定是黃麻纖維素合成酶基因。半定量RT-PCR分析表明，CcCesA1在植株不同部位表達量

9、具組織差異性，依次為莖部韌皮>根>葉>頂芽>麻骨。利用CcCesA1基因部分cDNA序列和3'UTR區(qū)，構(gòu)建黃麻CcCesA1基因反義載體，用測序驗證的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥。Southern結(jié)果表明，外源基因以單拷貝方式整合進入基因組，轉(zhuǎn)基因擬南芥生長嚴重受阻，植株變得矮小且莖部易彎曲倒伏，角果數(shù)量變少，長度變短，纖維素含量有不同程度的降低，本研究結(jié)果表明，所克隆的黃麻CcCesA1基因除了參與植物其他生理代謝過程外，還參與纖維素

10、的生物合成。
　　1.4黃麻咖啡酰-輔酶A甲基轉(zhuǎn)移酶(CCoAOMT)基因克隆與功能鑒定
　　成功分離了黃麻咖啡酰-輔酶A甲基轉(zhuǎn)移酶(CCoAOMT)基因,暫命名為CcCCoAOMT1，該基因cDNA全長609bp，編碼202個氨基酸，編碼蛋白的分質(zhì)量22.59887kD,理論等電點是5.59，CcCCoAOMT1生物信息學(xué)分析表明，該基因?qū)儆赑LN02589 Methyltransf-3氧甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員，RT-PCR分

11、析表明，該基因在根、莖皮、麻骨、葉中均有表達，其表達量為麻骨>根>莖皮>葉,轉(zhuǎn)基因擬南芥研究結(jié)果表明，攜帶CcCCoAOMT1基因的擬南芥與對照相比植株高度、角果長度、莖稈硬度增加，木質(zhì)素含量比對照增加(17%-21%)，表明該基因在植物的生長發(fā)育和木質(zhì)素代謝過程中起關(guān)鍵調(diào)控作用。
　　1.5尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGPase)轉(zhuǎn)化黃麻研究
　　以農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化無菌黃麻子葉節(jié)，提取所有轉(zhuǎn)化植株葉片DNA，對轉(zhuǎn)化植株

12、進行PCR和Southern雜交檢測，最后共確定有7株為轉(zhuǎn)基因陽性植株，對轉(zhuǎn)基因當(dāng)代植株分析表明，與對照相比轉(zhuǎn)基因的植株高度明顯增加，韌皮纖維中纖維素含量與對照相比增加(18%-22%)。該研究結(jié)果為利用UGPase基因改良黃麻品質(zhì)提供了新的視角。
　　1.6黃麻(CCoAOMT)基因RNAi載體和人工定向沉默載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化黃麻研究
　　利用韌皮部特異啟動子啟動GUS基因在煙草中的表達結(jié)果表明，與35S相比，韌皮部特異啟動子