基于腸易激綜合征模型的戊己丸藥代動力學研究.pdf

1、背景及目的：戊己丸是臨床上治療腸易激綜合征（Irritable bowel syndrome，IBS）的有效方劑，由黃連、制吳茱萸和土炒白芍組成，其中黃連為君藥，制吳茱萸和土炒白芍為臣藥。本課題組前期的戊己丸的藥代動力學(Pharmacokinetic，PK)研究是在正常動物體內(nèi)進行的，而未研究其在病理狀態(tài)下的PK。鑒于藥物主要是作用于病理狀態(tài)的機體，故研究病理狀態(tài)下的PK更有意義。此外，IBS是一種腸道功能紊亂但胃腸道結構無明顯異常的

2、疾病，而且腸道的IBS病理狀態(tài)對于藥物吸收的影響還不得而知。因此本課題旨在利用炎癥后IBS(PI-IBS)和慢性內(nèi)臟高敏感IBS(CVH-IBS)大鼠模型，采用UPLC-MS/MS的技術，比較鹽酸小檗堿標準品（小檗堿）、黃連（小檗堿和巴馬?。?、戊己丸（小檗堿、巴馬汀、吳茱萸堿、吳茱萸次堿和芍藥苷）單次給藥后，代表成分在正常大鼠和以上兩種IBS模型大鼠體內(nèi)的PK差異。在此基礎上，又比較了戊己丸單次以及多次給藥后，5個代表成分在正常大鼠和兩

3、種IBS模型大鼠體內(nèi)的PK差異，并應用免疫組化和免疫熒光技術，從大鼠結腸中的緊密連接蛋白（Occludin和ZO-1）、肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)以及轉運蛋白（P-gp、MRP1和MRP2）的角度探討戊己丸代表成分PK差異的原因。
　　方法和內(nèi)容：
　　1.UPLC-MS/MS法同時測定血漿中戊己丸五個代表成分含量的方法學研究采用蛋白沉淀法對血漿進行樣品前處理，建立同時測定血漿中戊己丸中的5個代表成分含量的UPLC-MS/

4、MS方法。
　　2.鹽酸小檗堿、黃連和戊己丸分別給藥后，各代表成分在正常大鼠和PI-IBS模型大鼠體內(nèi)的藥代動力學比較首先采用乙酸聯(lián)合束縛應激的方法建立PI-IBS大鼠模型，以大鼠的結腸運動、2h的排便糞粒數(shù)、玻璃小球排出時間為觀測指標，同時通過HE染色和甲苯胺藍染色觀察大鼠結腸的病理變化以及肥大細胞的數(shù)量變化對所建立的PI-IBS大鼠模型進行評價。待模型成功后，分別給正常大鼠及模型大鼠行頸靜脈插管手術，術后12h，通過插管采血0

5、.2mL于肝素化的EP管中，同時通過插管補充0.2mL的肝素鈉溶液(50IU/mL)。然后，分別灌胃給予鹽酸小檗堿（25mg/kg，相當于小檗堿22mg/kg)、黃連提取物(96mg/kg，分別相當于小檗堿22 mg/kg和巴馬汀5.3mg/kg)、戊己丸(157.4 mg/kg，分別相當于小檗堿22 mg/kg、巴馬汀5.3 mg/kg、吳茱萸堿0.055 mg/kg、吳茱萸次堿0.07 mg/kg和芍藥苷6.265 mg/kg)，并

6、于給藥后5 min、15 min、30 min、1h、1.5 h、2h、3h、4h、6h、8h、10h、12h、24 h、36h通過插管采血0.2mL于肝素化的EP管中，同時通過插管補充0.2mL的肝素鈉溶液(50IU/mL)。離心，取血漿100μL，凍存于-80℃。然后采用UPLC-MS/MS技術測定代表成分的含量。繪制藥時曲線，并利用WinNonlin軟件計算藥代參數(shù)(T1/2、Tmax、Cmax、AUC0-t、Vd/F和Cl/F)

7、，比較各代表成分在正常大鼠和PI-IBS模型大鼠體內(nèi)的PK差異。
　　3.鹽酸小檗堿、黃連和戊己丸分別給藥后，各代表成分在正常大鼠和CVH-IBS模型大鼠體內(nèi)的藥代動力學比較首先采用乳鼠結腸PTCA球囊刺激的方法建立CVH-IBS大鼠模型，以大鼠的每周體重變化、腹部抬起和弓背抬高閾值為觀測指標，通過HE染色和甲苯胺藍染色觀察大鼠結腸的病理變化及肥大細胞的數(shù)量變化，而且應用免疫組化技術分析結腸中的原癌基因c-fos表達的變化對所建立

8、的CVH-IBS大鼠模型進行評價。待模型成功后，同2.2方法給藥、取血漿、測定代表成分含量，繪制藥時曲線，并利用WinNonlin軟件計算藥代參數(shù)（T1/2、 Tmax、Cmax、AUC0-t、Vd/F和Cl/F），比較各代表成分在正常大鼠和CVH-IBS模型大鼠體內(nèi)的PK差異。
　　4.戊己丸單次給藥及多次給藥后，5個代表成分在正常大鼠和PI-IBS模型大鼠體內(nèi)的藥代動力學比較及其機制研究按“2.2”方法建立PI-IBS大鼠模型

9、。待模型成功后，分別用于戊己丸高劑量單次給藥及多次給藥的藥代動力學研究。單次給藥時，給大鼠灌胃戊己丸(629.6mg/kg，分別相當于小檗堿88 mg/kg、巴馬汀21.1 mg/kg、吳茱萸堿0.22 mg/kg、吳茱萸次堿0.28 mg/kg和芍藥苷25.1 mg/kg);對于多次給藥，連續(xù)給藥6天，每天一次，給藥量同單次給藥，在第6天給藥后12h，對各大鼠行頸靜脈插管，術后12h后，給大鼠灌胃戊己丸(629.6 mg/kg，分別相

10、當于小檗堿88 mg/kg、巴馬汀21.1mg/kg、吳茱萸堿0.22 mg/kg、吳茱萸次堿0.28 mg/kg和芍藥苷25.1mg/kg)，并于給藥后按“2.2”所示時間點取血漿，然后用“2.1”所建立的方法檢測5個代表成分的含量。繪制藥時曲線，并利用WinNonlin軟件計算藥代參數(shù)（T1/2、Tmax、 Cmax、AUC0-t、Vd/F和Cl/F），然后比較戊己丸高劑量單次給藥及多次給藥各代表成分的藥代參數(shù)在正常組和模型組的差異

11、。36h的采血點完畢后，處死大鼠，迅速取兩段結腸，一段固定到2.5％的戊二醛溶液中，另一段固定到4％的多聚甲醛中，石蠟包埋切片。首先采用透射電鏡觀察大鼠結腸上皮緊密連接的超微結構，然后采用免疫組化和免疫熒光技術檢測大鼠結腸中的緊密連接蛋白(Occludin和ZO-1)、肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)和轉運蛋白（P-gp、MRP1和MRP2）的表達，探討戊己丸中的5個代表成分在正常大鼠和PI-IBS模型大鼠體內(nèi)的PK差異的機制。
　　

12、5.戊己丸單次給藥及多次給藥在正常大鼠和CVH-IBS模型大鼠體內(nèi)的藥代動力學比較及其機制研究按“2.3”方法建立CVH-IBS大鼠模型。待模型成功后，分別按照“2.4”方法研究戊己丸高劑量單次給藥及多次給藥在正常大鼠和CVH-IBS模型大鼠體內(nèi)的藥代動力學差異及其機制研究。
　　結果：
　　1.UPLC-MS/MS法同時測定血漿中戊己丸5個代表成分含量的方法學研究本文建立的UPLC-MS/MS法可同時測定血漿中的戊己丸5個

13、代表成分的含量，方法專屬性好，靈敏準確。
　　2.鹽酸小檗堿、黃連和戊己丸分別給藥后，各代表成分在正常大鼠和PI-IBS模型大鼠體內(nèi)的藥代動力學比較本實驗采用乙酸聯(lián)合束縛應激的方法建立的PI-IBS模型大鼠體重略微下降、結腸運動障礙、排便異常、肥大細胞數(shù)目顯著增多，較好的模擬了臨床上PI-IBS的癥狀，可以作為PI-IBS的動物模型用于科學研究。
　　通過對鹽酸小檗堿、黃連和戊己丸的代表成分在正常大鼠和PI-IBS模型大鼠體

14、內(nèi)的藥代動力學的研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比:(1)給予鹽酸小檗堿后，小檗堿在PI-IBS大鼠體內(nèi)的AUC0-t顯著增加，Cl/F顯著降低。(2)灌胃黃連提取物后，小檗堿在PI-IBS大鼠體內(nèi)的Cmax和AUC0-t顯著增加，Vd/F和Cl/F顯著降低，而巴馬汀在PI-IBS大鼠體內(nèi)的AUC0-t顯著增加，其他的藥代參數(shù)未見顯著差異。除此之外，在模型大鼠體內(nèi)，小檗堿和巴馬汀均出現(xiàn)了雙峰。(3)給予戊己丸后，小檗堿在PI-IBS大鼠體內(nèi)的Cma

15、x和AUC0-t顯著增加，Vd/F和Cl/F顯著降低;巴馬汀在PI-IBS大鼠體內(nèi)的AUC0-t顯著增加，T1/2和Cl/F顯著降低;芍藥苷在PI-IBS大鼠體內(nèi)的Cmax和AUC0-t顯著增加，Vd/F和Cl/F顯著降低。
　　3.鹽酸小檗堿、黃連和戊己丸分別給藥后，各代表成分在正常大鼠和CVH-IBS模型大鼠體內(nèi)的藥代動力學比較本實驗采用乳鼠結腸PTCA球囊刺激的方法建立的CVH-IBS大鼠模型表現(xiàn)出了內(nèi)臟痛覺超敏、肥大細胞顯

16、著增多，而且原癌基因c-fos的表達顯著升高，進一步佐證了內(nèi)臟超敏的原因。因此，該模型可以作為CVH-IBS的動物模型用于科學研究。
　　通過對鹽酸小檗堿、黃連提取物和戊己丸的代表成分在正常大鼠和CVH-IBS大鼠體內(nèi)的藥代動力學的研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比:(1)給予鹽酸小檗堿后，小檗堿在CVH-IBS大鼠體內(nèi)的T1/2和AUC0-t顯著增加，Cl/F顯著降低。(2)灌胃黃連提取物后，小檗堿在CVH-IBS大鼠體內(nèi)的T1/2、Tma

17、x和AUC0-t顯著增加，Vd/F和Cl/F顯著降低，而巴馬汀的藥代參數(shù)未見顯著差異。(3)給予戊己丸后，小檗堿在CVH-IBS大鼠體內(nèi)的AUC0-t顯著增加，T1/2、Cmax、Vd/F和Cl/F顯著降低;巴馬汀在CVH-IBS大鼠體內(nèi)的Cmax和AUC0-t顯著增加，Tmax、 Vd/F和Cl/F顯著降低;吳茱萸堿在CVH-IBS大鼠體內(nèi)的Cmax顯著增加，Tmax、Vd/F和Cl/F顯著降低;吳茱萸次堿在CVH-IBS大鼠體內(nèi)的C

18、max和AUC0-t顯著增加，Vd/F顯著降低;芍藥苷在CVH-IBS大鼠體內(nèi)的Cmax和AUC0-t顯著增加，Vd/F和Cl/F顯著降低。
　　4.戊己丸單次給藥及多次給藥在正常大鼠和PI-IBS模型大鼠體內(nèi)的藥代動力學比較及其機制研究戊己丸高劑量單次給藥及多次給藥后其5個代表成分在正常大鼠和PI-IBS模型大鼠體內(nèi)的藥代動力學的研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比:(1)戊己丸高劑量單次給藥后，小檗堿在PI-IBS大鼠體內(nèi)的T1/2、 Tm

19、ax、Cmax和AUC0-t顯著增加，Cl/F顯著降低;巴馬汀在PI-IBS大鼠體內(nèi)的AUC0-t顯著增加，Vd/F和Cl/F顯著降低;吳茱萸堿在PI-IBS大鼠體內(nèi)的Tmax、Cmax和AUC0-t顯著增高，Cl/F顯著降低;吳茱萸次堿在PI-IBS模型大鼠體內(nèi)的AUC0-t顯著增高，Vd/F和Cl/F顯著降低;芍藥苷在PI-IBS模型大鼠體內(nèi)的Cmax和AUC0-t顯著增高，Vd/F和Cl/F顯著降低。(2)戊己丸高劑量多次給藥后，

20、小檗堿在PI-IBS大鼠體內(nèi)的Cmax和AUC0-t顯著增加，Tmax、Vd/F和Cl/F顯著降低;巴馬汀在PI-IBS大鼠體內(nèi)的T1/2和AUC0-t顯著增加，Tmax、VdF和Cl/F顯著降低;吳茱萸堿在PI-IBS大鼠體內(nèi)的Cmax和AUC0-t顯著增高，T1/2、Tmax、VgF和Cl/F顯著降低;吳茱萸次堿在PI-IBS模型大鼠體內(nèi)的Cmax顯著增高，Tmax、T1/2、Vd/F和Cl/F顯著降低;芍藥苷在PI-IBS模型大鼠

21、體內(nèi)的T1/2、 Cmax和AUC0-t顯著增高，Cl/F顯著降低。(3)透射電鏡的結果表明:正常組大鼠結腸上皮緊密連接結構完整、連接致密;模型組大鼠結腸上皮緊密連接結構破壞，連接疏松、間隙增寬、密度降低;而戊己丸給藥一周后，結腸上皮緊密連接結構較模型組恢復完整，連接恢復。(4)免疫組化的結果表明:對于緊密連接蛋白Occludin和ZO-1，與正常組相比，在PI-IBS模型組大鼠結腸中顯著下降。多次給藥后，它們在模型組的表達顯著高于給藥

22、前的模型組，而在正常組的表達與給藥前的正常組無明顯差異。但是多次給藥后的正常組和模型組相比，在模型組的表達低于正常組;對于MLCK，與正常組相比，在PI-IBS模型組大鼠結腸中顯著升高。多次給藥后，它們在模型組的表達顯著低于給藥前的模型組，而在正常組的表達與給藥前的正常組無明顯差異。但是多次給藥后的正常組和模型組相比，在模型組的表達高于正常組;對于轉運蛋白P-gp、MRP1和MRP2，與正常組相比，在PI-IBS模型組大鼠結腸中的表達未

23、見明顯變化。多次給藥后，它們在模型組和正常組內(nèi)的表達均顯著高于給藥前相應的正常組和模型組，但是多次給藥后的正常組和模型組相比，它們的表達未見明顯差異。(5)免疫熒光的結果表明:與正常組相比，模型組內(nèi)的緊密連接表達下降，MLCK的表達升高。但是多次給藥后，模型組大鼠結腸中緊密連接蛋白的表達顯著高于給藥前的模型組，而MLCK的表達顯著低于給藥前的模型組。多次給藥后的正常組，緊密連接蛋白和MLCK的表達與給藥前的正常組無明顯差異。而多次給藥后

24、的正常組和模型組相比，緊密連接蛋白在模型組的表達低于正常組，MLCK的表達高于正常組。
　　5.戊己丸單次給藥及多次給藥在正常大鼠和CVH-IBS模型大鼠體內(nèi)的藥代動力學比較及其機制研究戊己丸高劑量單次給藥及多次給藥后其5個代表成分在正常大鼠和CVH-IBS大鼠體內(nèi)的藥代動力學的研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比:(1)戊己丸高劑量單次給藥后，小檗堿和巴馬汀在CVH-IBS大鼠體內(nèi)的T1/2和AUC0-t顯著增加，Cl/F顯著降低;吳茱萸堿在

25、CVH-IBS大鼠體內(nèi)的Cmax和AUC0-t顯著增高，T1/2、Tmax、Vd/F和Cl/F無顯著性差異;吳茱萸次堿在CVH-IBS模型大鼠體內(nèi)的各藥代參數(shù)均無顯著性差異;芍藥苷在CVH-IBS模型大鼠體內(nèi)的Tmax和AUC0-t顯著增高，Cl/F顯著降低。(2)戊己丸高劑量多次給藥后，小檗堿和巴馬汀在CVH-IBS大鼠體內(nèi)的T1/2、 Vd/F和Cl/F顯著增加，Cmax和AUC0-t顯著降低;吳茱萸堿在CVH-IBS大鼠體內(nèi)的Cm

26、ax和AUC0-t顯著增高，T1/2、Tmax和Vd/F顯著降低;吳茱萸次堿在CVH-IBS模型大鼠體內(nèi)的Cmax顯著增高，Tmax顯著降低;芍藥苷在CVH-IBS模型大鼠體內(nèi)的Tmax顯著增高，而T1/2、Cmax、AUC0-t、Vd/F和Cl/F無顯著性差異。(3)透射電鏡的結果表明:正常組大鼠結腸上皮緊密連接結構完整、連接致密;模型組大鼠結腸上皮緊密連接結構破壞，連接疏松、間隙增寬、密度降低;而戊己丸給藥一周后，結腸上皮緊密連接結

27、構較模型組恢復完整，連接恢復。(4)免疫組化的結果表明:對于緊密連接蛋白Occludin和ZO-1，與正常組相比，在CVH-IBS模型組大鼠結腸中顯著下降。多次給藥后，它們在模型組的表達顯著高于給藥前的模型組，而在正常組的表達與給藥前的正常組無明顯差異。但是多次給藥后的正常組和模型組相比，在模型組的表達低于正常組;對于MLCK，與正常組相比，在CVH-IBS模型組大鼠結腸中顯著升高。多次給藥后，它們在模型組的表達顯著低于給藥前的模型組，

28、而在正常組的表達與給藥前的正常組無明顯差異。但是多次給藥后的正常組和模型組相比，在模型組的表達高于正常組;對于轉運蛋白P-gp、MRP1和MRP2，與正常組相比，在CVH-IBS模型組大鼠結腸中的表達未見明顯變化。多次給藥后，它們在模型組和正常組內(nèi)的表達均顯著高于給藥前相應的正常組和模型組。但是多次給藥后的正常組和模型組相比，它們在模型組的表達顯著高于正常組。(5)免疫熒光的結果表明:與正常組相比，模型組內(nèi)的緊密連接表達下降，MLCK的

29、表達升高。但是多次給藥后的模型組，緊密連接蛋白的表達顯著高于給藥前的模型組，而MLCK的表達顯著低于給藥前的模型組。多次給藥后的正常組，緊密連接蛋白和MLCK的表達與給藥前的正常組無明顯差異。而多次給藥后的正常組和模型組相比，緊密連接蛋白在模型組的表達低于正常組，MLCK的表達高于正常組。
　　結論：戊己丸單次給藥及多次給藥后在正常動物和腸易激綜合征的病理狀態(tài)下的藥代動力學行為存在明顯差異，其差異的機制可能與轉運蛋白和緊密連接蛋白