肥胖大鼠對(duì)心肌缺血-再灌注損傷防御功能下調(diào)的機(jī)制探討.pdf

1、第一部分:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)肥胖大鼠心肌結(jié)構(gòu)和功能的改變及缺血/再灌注易損性研究
　　目的:作為冠心病的重要危險(xiǎn)因素，肥胖是目前全世界面臨的公共衛(wèi)生難題。然而，傳統(tǒng)的觀察研究卻發(fā)現(xiàn)那些已經(jīng)罹患冠心病的肥胖患者生存率更高，這就是所謂的“肥胖悖論”。肥胖真的對(duì)冠心病的預(yù)后有保護(hù)作用嗎？本研究擬驗(yàn)證肥胖大鼠是否對(duì)急性心肌缺血/再灌注損傷更為易感，并探討其可能的分子機(jī)制。
　　方法:64只4～6周齡的雄性wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周以后隨機(jī)

2、分為兩組，其中對(duì)照組(n=32)給予正常飼料喂養(yǎng)、肥胖組(n=32)給予高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料中含有1％的膽固醇和15％的豬油，24周后肥胖動(dòng)物模型建成。其中，第12周末對(duì)照組剔除肥胖易感大鼠（6只），肥胖組剔除肥胖抵抗大鼠（7只）。24周內(nèi)，密切隨訪大鼠的體重和身長。分別在12周末和24周末檢查大鼠的血糖、血脂并用心超評(píng)價(jià)心臟結(jié)構(gòu)和功能。然后通過阻斷冠狀動(dòng)脈前降支的方法建立急性心肌缺血/再灌注損傷模型（對(duì)照組n=12只建模成功8只，肥

3、胖組n=15只建模成功12只），其中缺血時(shí)間30分鐘、再灌注時(shí)間120分鐘。實(shí)驗(yàn)過程中監(jiān)測(cè)大鼠的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)以及心律失常的發(fā)生率，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后以伊文氏藍(lán)和TTC分別染色，計(jì)算缺血面積和梗死面積。未行缺血/再灌注損傷的大鼠予以處死，留取標(biāo)本進(jìn)行HE染色觀察心肌結(jié)構(gòu)、TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡，透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變以及提取總RNA用以逆轉(zhuǎn)錄并以實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)caveolin-3和KATP各亞單位的mRNA水平進(jìn)行定量，提取

4、蛋白質(zhì)并以western-blot檢測(cè)caveolin-3和KATP各亞單位在細(xì)胞膜和胞漿表達(dá)量。對(duì)照研究兩組大鼠的差異性。
　　結(jié)果:肥胖大鼠的體重、身長、體質(zhì)指數(shù)均較對(duì)照組明顯升高，12周末其生化指標(biāo)空腹血糖、低密度脂蛋白及總膽固醇就開始出現(xiàn)顯著差異。盡管心超檢查提示肥胖大鼠的左房內(nèi)徑和左室后壁厚度較對(duì)照組增加，二者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（24周p＜0.01），但是肥胖大鼠的射血分?jǐn)?shù)和左室短軸縮短率較對(duì)照組相比無明顯改變。它們的每搏輸出

5、量和每分鐘輸出量的差別經(jīng)過體重校正以后也沒有差異。但是心肌結(jié)構(gòu)檢查發(fā)現(xiàn)心肌的脂質(zhì)沉積以及心肌細(xì)胞的凋亡率在肥胖大鼠心肌開始增加，透射電鏡檢查甚至發(fā)現(xiàn)部分小窩結(jié)構(gòu)破壞。心肌缺血/再灌注過程中，肥胖大鼠的耐受性明顯降低，表現(xiàn)為比對(duì)照組更高的死亡率、嚴(yán)重的血流動(dòng)力學(xué)障礙、室性心律失常增加。盡管實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)肥胖大鼠的caveolin-3和KATP各亞單位的mRNA水平較對(duì)照組明顯增加，但是western-blot和免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)ca

6、veolin-3在細(xì)胞膜上的定位明顯減少，western-blot發(fā)現(xiàn)kir6.2在細(xì)胞膜上的表達(dá)也在減少。
　　結(jié)論:通過高飽和脂肪酸飲食喂養(yǎng)wistar大鼠可以建立肥胖動(dòng)物模型。經(jīng)過24周的喂養(yǎng)，盡管肥胖大鼠的心功能仍然處于代償狀態(tài)，但是心肌重構(gòu)明顯，經(jīng)過缺血/再灌注損傷以后，血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)明顯下降同時(shí)伴有惡性心律失常和心梗面積增加，提示肥胖可能導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)源性防御機(jī)制受損，心肌缺血/再灌注耐受性下降、易感性增加。caveoli

7、n-3和Kir6.2在細(xì)胞膜上的定位減少可能是高脂飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠心肌重構(gòu)并對(duì)缺血/再灌注損傷易感性增加的原因。
　　第二部分:離體實(shí)驗(yàn)棕櫚酸對(duì)H9C2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧耐受性的影響及機(jī)制探討
　　目的:在體實(shí)驗(yàn)證實(shí)，肥胖導(dǎo)致的心肌重構(gòu)削弱了心肌對(duì)缺血/再灌注損傷的內(nèi)源性保護(hù)作用。但是肥胖導(dǎo)致心肌重構(gòu)的機(jī)制非常復(fù)雜，也很難闡明是哪一種機(jī)制對(duì)缺血/再灌注損傷(MIRI)起作用。我們假定是肥胖個(gè)體的心肌能量代謝障礙對(duì)MIRI起主

8、要作用。以此建立體外模型觀察研究。
　　方法:已有研究證實(shí)棕櫚酸可以通過刺激細(xì)胞產(chǎn)生活性氧簇(ROS)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，所以本研究給以較低劑量的棕櫚酸(0.25mmol/L)干預(yù)H9C2心肌細(xì)胞，然后給予物理性的缺氧/復(fù)氧損傷過程（2小時(shí)/24小時(shí)）處理，使用CCK-8試劑盒觀察細(xì)胞增殖個(gè)數(shù)，JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒觀察細(xì)胞的線粒體膜電位耗散情況，并以AnnexinⅤ/PI染色流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)分析細(xì)胞的凋亡程度。同樣使用qPC

9、R技術(shù)對(duì)照研究棕櫚酸-氫氧化鉀組和氫氧化鉀組H9C2心肌細(xì)胞caveolin-3和KATP各亞單位的mRNA水平;western-blot驗(yàn)證caveolin-3和Kir6.2在細(xì)胞膜上的定位情況有無差異，增加測(cè)定兩組心肌細(xì)胞線粒體蛋白中凋亡家族基因bax/bcl-2的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。為驗(yàn)證是否存在KATP的功能障礙，予以加用KATP開放劑二氮嗪預(yù)處理后進(jìn)一步觀察對(duì)H9C2心肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
　　結(jié)果:棕櫚酸抑制了H9C2

10、心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧過程中的增殖水平，同時(shí)通過降低線粒體膜電位水平誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率比氫氧化鉀組增加。離體實(shí)驗(yàn)中棕櫚酸干預(yù)過的H9C2心肌細(xì)胞caveolin-3和KATP各亞單位mRNA水平均較對(duì)照組明顯增加，這與在體實(shí)驗(yàn)的結(jié)果基本一致。但是western-blot只發(fā)現(xiàn)棕櫚酸干預(yù)后caveolin-3的膜定位減少。同時(shí)，棕櫚酸干預(yù)后線粒體凋亡基因蛋白質(zhì)Bax/bcl-2的比值明顯較氫氧化鉀組上調(diào)，提示細(xì)胞凋亡通過線粒體凋亡通路。二氮嗪預(yù)處

11、理可以在一定程度上改善棕櫚酸預(yù)處理組H9C2心肌細(xì)胞的增殖水平、維持線粒體膜電位、減少細(xì)胞凋亡，但是對(duì)caveolin-3的定位沒有影響，對(duì)氫氧化鉀組細(xì)胞增殖和線粒體膜電位也無影響。同時(shí)棕櫚酸組與氫氧化鉀組平行對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)即使加入二氮嗪預(yù)處理，二者之間仍然存在顯著差異。
　　結(jié)論:離體實(shí)驗(yàn)基本復(fù)制了在體實(shí)驗(yàn)中肥胖對(duì)心肌缺血/再灌注損傷的結(jié)果，心肌飽和脂肪酸代謝所致的線粒體膜電位下降與caveolin-3定位異常有關(guān)，同時(shí)經(jīng)過線粒體