棗cDNA-AFLP技術(shù)體系優(yōu)化及其在抗棗瘋病相關(guān)基因片段篩選中的應(yīng)用.pdf

1、棗(Ziziphus jujuba Mill．)是我國(guó)重要的特色果樹。棗瘋病是由植原體(Phytoplasma)引起的致死性傳染病害，對(duì)棗產(chǎn)業(yè)危害極大。為了更高效的利用已經(jīng)獲得的抗棗瘋病種質(zhì)，利用分子生物學(xué)的手段和方法揭示抗病品種的抗病機(jī)制并挖掘其抗病基因，對(duì)開(kāi)展抗棗瘋病基因工程育種及類似植原體病害研究具有重要意義。 本試驗(yàn)利用cDNA-AFLP技術(shù)，以感病品種婆棗等為對(duì)照，研究了抗棗瘋病品種“星光”在植原體侵染前后不同時(shí)期的基

2、因表達(dá)差異。獲得如下結(jié)果： 1 建立了一套適合于棗的改良CTAB-LiCl法提取總RNA的技術(shù)體系。針對(duì)棗組織中富含多糖多酚的特點(diǎn)，改進(jìn)了CTAB法，采用β-巰基乙醇和PVP去除酚類，KAc及無(wú)水乙醇去除多糖，LiCl沉淀過(guò)夜，提取得到的RNA產(chǎn)率高，電泳條帶整齊、清晰，A<,260>/A<,280>介于1.8～2.0之間，A<,260>/A<,230>均大于2.0，證明得到的RNA純度和完整性均較高，蛋白、多糖及酚類等去除較徹

3、底。本試驗(yàn)建立的棗總RNA改良CTAB-LiCl法的提取優(yōu)化體系為：2.0％CTAB，1.4 mol/L NaCl，100 mmol/L Tris-Cl pH 8.0，20 mmol/L EDTA pH 8.0，2.0％PVP-40，2.0％β-巰基乙醇。 2 建立了棗cDNA-AFLP分析的優(yōu)化體系和反應(yīng)程序。將得到的全長(zhǎng)cDNA用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ(識(shí)別6個(gè)堿基位點(diǎn))與Mse Ⅰ(識(shí)別4個(gè)堿基位點(diǎn))酶切，酶切后的cDN

4、A片段帶有兩種粘性末端，分別連接上與之對(duì)應(yīng)的兩種接頭，得到代表?xiàng)椉?xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜且?guī)в薪宇^的cDNA片段池(pool)。使用與接頭序列互補(bǔ)的預(yù)擴(kuò)引物對(duì)cDNA片段池進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使cDNA片段池中不同豐度的基因片段都達(dá)到一定的濃度。對(duì)擴(kuò)增后的cDNA池定量至1ng/μl，作為選擇性擴(kuò)增的模板。對(duì)AFLP選擴(kuò)反應(yīng)進(jìn)行了摸索和優(yōu)化試驗(yàn)，優(yōu)化得到的AFLP選擴(kuò)反應(yīng)體系為：20μl的反應(yīng)體系中含5μl模板，2μl 10×PCR buffer，2μ

5、l MgCl<,2>(25mM)，EcoRI特異性引物(50ng/μl)1μl，MseI特異性引物(50ng/μl)1μl，10mM dNTP 0.4μl，5u TaqDNA Polymerase 0.12μl。反應(yīng)程序：第一個(gè)循環(huán)是94℃預(yù)變性2min；接著94℃變性30s，65℃退火30s(每個(gè)循環(huán)降0.7℃)，72℃延伸1min，循環(huán)13次；然后94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1 min，循環(huán)31次；最后一個(gè)循環(huán)完成