棗cDNA-AFLP技術體系優(yōu)化及其在抗棗瘋病相關基因片段篩選中的應用.pdf

1、棗(Ziziphus jujuba Mill．)是我國重要的特色果樹。棗瘋病是由植原體(Phytoplasma)引起的致死性傳染病害，對棗產業(yè)危害極大。為了更高效的利用已經獲得的抗棗瘋病種質，利用分子生物學的手段和方法揭示抗病品種的抗病機制并挖掘其抗病基因，對開展抗棗瘋病基因工程育種及類似植原體病害研究具有重要意義。 本試驗利用cDNA-AFLP技術，以感病品種婆棗等為對照，研究了抗棗瘋病品種“星光”在植原體侵染前后不同時期的基

2、因表達差異。獲得如下結果： 1 建立了一套適合于棗的改良CTAB-LiCl法提取總RNA的技術體系。針對棗組織中富含多糖多酚的特點，改進了CTAB法，采用β-巰基乙醇和PVP去除酚類，KAc及無水乙醇去除多糖，LiCl沉淀過夜，提取得到的RNA產率高，電泳條帶整齊、清晰，A<,260>/A<,280>介于1.8～2.0之間，A<,260>/A<,230>均大于2.0，證明得到的RNA純度和完整性均較高，蛋白、多糖及酚類等去除較徹

3、底。本試驗建立的棗總RNA改良CTAB-LiCl法的提取優(yōu)化體系為：2.0％CTAB，1.4 mol/L NaCl，100 mmol/L Tris-Cl pH 8.0，20 mmol/L EDTA pH 8.0，2.0％PVP-40，2.0％β-巰基乙醇。 2 建立了棗cDNA-AFLP分析的優(yōu)化體系和反應程序。將得到的全長cDNA用限制性內切酶EcoR Ⅰ(識別6個堿基位點)與Mse Ⅰ(識別4個堿基位點)酶切，酶切后的cDN

4、A片段帶有兩種粘性末端，分別連接上與之對應的兩種接頭，得到代表棗細胞轉錄圖譜且?guī)в薪宇^的cDNA片段池(pool)。使用與接頭序列互補的預擴引物對cDNA片段池進行PCR擴增，使cDNA片段池中不同豐度的基因片段都達到一定的濃度。對擴增后的cDNA池定量至1ng/μl，作為選擇性擴增的模板。對AFLP選擴反應進行了摸索和優(yōu)化試驗，優(yōu)化得到的AFLP選擴反應體系為：20μl的反應體系中含5μl模板，2μl 10×PCR buffer，2μ

5、l MgCl<,2>(25mM)，EcoRI特異性引物(50ng/μl)1μl，MseI特異性引物(50ng/μl)1μl，10mM dNTP 0.4μl，5u TaqDNA Polymerase 0.12μl。反應程序：第一個循環(huán)是94℃預變性2min；接著94℃變性30s，65℃退火30s(每個循環(huán)降0.7℃)，72℃延伸1min，循環(huán)13次；然后94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1 min，循環(huán)31次；最后一個循環(huán)完成