鯉魚(yú)cDNA-AFLP技術(shù)反應(yīng)體系建立和組織差異表達(dá)研究.pdf

1、cDNA-AFLP(cDNA-amplifiedfragmentlengthpolymorphism，cDNA-AFLP)分子標(biāo)記技術(shù)是結(jié)合了mRNA差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(DifferentialdisplayreversetranscriptasePCR，DDRT-PCR)和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多(Amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)而發(fā)展而來(lái)的一種檢測(cè)cDNA多態(tài)性的方法。該技術(shù)具

2、有無(wú)需了解序列信息、靈敏性高、重復(fù)性好和操作相對(duì)方便等優(yōu)點(diǎn)，可對(duì)生物體轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行全面的分析。由于生物體的進(jìn)化地位和組織結(jié)構(gòu)的差異，適用于不同生物間的具體反應(yīng)方案存在差別。本研究通過(guò)對(duì)cDNA-AFLP技術(shù)關(guān)鍵步驟的優(yōu)化和改進(jìn)，首次建立了適合于鯉魚(yú)的cDNA-AFLP技術(shù)反應(yīng)體系。利用建立的反應(yīng)體系對(duì)設(shè)計(jì)的標(biāo)記進(jìn)行了篩選，獲得了69對(duì)多態(tài)性較好的cDNA-AFLP標(biāo)記紐合，并將它用于鯉魚(yú)免疫相關(guān)組織基因差異表達(dá)研究，獲得了初步的差異信息。

3、本研究的內(nèi)容和結(jié)果主要包括：
　　 1.鯉魚(yú)cDNA-AFLP技術(shù)反應(yīng)體系的建立
　　 以德國(guó)鏡鯉的腦組織為材料，通過(guò)對(duì)RNA的用量，酶切，連接，預(yù)擴(kuò)增和選擇擴(kuò)增各個(gè)關(guān)鍵步驟的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，獲得了適合鯉魚(yú)的cDNA-AFLP反應(yīng)體系。結(jié)果表明，采用MseI和BstYI酶切鯉魚(yú)cDNA100ng，分別處理2h和3h后，以接頭濃度分別為2pmol/ul和0.2pmol/ul、酶濃度為0.12U/ul的反應(yīng)體系進(jìn)行連接；預(yù)擴(kuò)增后以

4、50倍稀釋的產(chǎn)物為模板、BstYI和MseI比例為1:4的引物配比進(jìn)行選擇擴(kuò)增可得到穩(wěn)定的擴(kuò)增結(jié)果。本研究建立的cDNA-AFLP技術(shù)將為鯉魚(yú)轉(zhuǎn)錄組研究建立技術(shù)支持和平臺(tái)。
　　 2.德國(guó)鏡鯉cDNA-AFLP分子標(biāo)記的篩選
　　 以液氮保存的德國(guó)鏡鯉腦組織和脾組織為材料，利用構(gòu)建的cDNA-AFLP技術(shù)反應(yīng)體系為基礎(chǔ)，對(duì)不同的引物標(biāo)記組合進(jìn)行篩選，獲得了適合于德國(guó)鏡鯉腦和脾組織中的cDNA-AFLP分子標(biāo)記。通過(guò)對(duì)12

5、個(gè)MseI-NN與8個(gè)BstYI-T/C-N組合成的96對(duì)引物進(jìn)行選擇擴(kuò)增，共獲得了69對(duì)擴(kuò)增條帶數(shù)目在40-56之間的引物組合。篩選出的標(biāo)記組合為鯉魚(yú)的差異表達(dá)和轉(zhuǎn)錄研究提供了基礎(chǔ)材料。
　　 3.鯉魚(yú)不同免疫相關(guān)組織的基因差異表達(dá)的初步分析
　　 以鴨綠江水域高密度網(wǎng)箱養(yǎng)殖的德國(guó)鏡鯉為材料，在魚(yú)病爆發(fā)期采集染病個(gè)體和正常個(gè)體的新鮮腦和脾為樣本，采用構(gòu)建的鯉魚(yú)反應(yīng)體系，選取篩選獲得的69對(duì)MseI-NN和BstYI-T

6、/C-N標(biāo)記組合進(jìn)行不同時(shí)期、不同組織之間的基因差異表達(dá)研究。初步結(jié)果如下：
　　 (1)腦組織在正常和染病兩種狀態(tài)下的遺傳距離及遺傳相似度分別為0.2434和0.7857，脾組織為0.2437和0.7855。正常和染病狀態(tài)下腦組織表達(dá)遺傳分化指數(shù)(coefficientofgenedifferentiation，Gst)為0.2560，脾組織為0.2678。聚類結(jié)果顯示出來(lái)自同一狀態(tài)下樣本的遺傳距離更接近，且經(jīng)過(guò)聚類后基本能和

7、另一種時(shí)期的個(gè)體區(qū)分開(kāi)來(lái)。正常和染病組之間的遺傳分析結(jié)果和聚類分析結(jié)果均能反映出正常和染病兩種狀態(tài)下組織內(nèi)基因的表達(dá)呈現(xiàn)較明顯的差異。
　　 (2)無(wú)論是在正?；蛘呷静顟B(tài)，腦組織的表達(dá)總量略高于脾組織。共獲得腦組織差異表達(dá)片段45個(gè)，脾組織差異表達(dá)片段55個(gè)。顯著差異中，不僅存在表達(dá)豐度上的不同，同時(shí)也存在質(zhì)的差別。正常狀態(tài)下，兩種組織表達(dá)顯著差異的類型都是以表達(dá)量的差異占主導(dǎo)。在染病后，兩種組織在表達(dá)量上的變化不明顯，但是表