miRNA-145基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞株的建立及其增殖侵襲能力的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　建立穩(wěn)定過表達(dá)、沉默表達(dá)及空載表達(dá)miRNA-145基因的人肺腺癌A549細(xì)胞株，并驗(yàn)證miRNA-145在A549細(xì)胞中增殖和侵襲能力的影響。
　　方法：
　　1.建立miRNA-145基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞株。通過G418篩選實(shí)驗(yàn)確定G418最佳篩選濃度；將含有過表達(dá)、沉默表達(dá)及空載表達(dá)miRNA-145基因的重組質(zhì)粒，應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染入人肺腺癌A549細(xì)胞，并通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光

2、蛋白的方法以及應(yīng)用流式細(xì)胞儀直接測定轉(zhuǎn)染效率，經(jīng)G418加壓篩選，得到穩(wěn)定過表達(dá)miRNA-145基因的新肺腺癌細(xì)胞株（命名為A549/H）、沉默表達(dá)miRNA-145基因的新肺腺癌細(xì)胞株（命名為A549/L）及空載表達(dá)miRNA-145基因的新肺腺癌細(xì)胞株（命名為A549/E）。按照試劑盒進(jìn)行miRNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄，miRNA-145和U6引物均為廣州佰而林公司設(shè)計(jì)及合成。設(shè)置反應(yīng)條件后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后應(yīng)用軟件

3、進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得出擴(kuò)增曲線和熔解曲線。對比穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后各實(shí)驗(yàn)組的miRNA-145基因表達(dá)量，以確保獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。
　　2.驗(yàn)證過表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后A549/H細(xì)胞的增殖及侵襲能力的變化。實(shí)驗(yàn)分組：A549/H細(xì)胞；A549/E細(xì)胞；A549細(xì)胞。應(yīng)用CCK8法檢測三組細(xì)胞存活生長情況：觀察三組細(xì)胞的生長曲線，研究比較A549/H細(xì)胞的增殖能力的變化。通過Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測三組細(xì)胞的體外侵襲能力的變化。
　

4、　結(jié)果：
　　1.通過G418篩選最佳濃度測定實(shí)驗(yàn)，最終確定200μg/ml的G418濃度為篩選濃度。
　　2.通過計(jì)數(shù)發(fā)綠色熒光的細(xì)胞及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，過表達(dá)組、沉默表達(dá)組及空載表達(dá)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均約為80％。
　　3.qRT-PCR結(jié)果顯示：與A549細(xì)胞組相比，A549/H細(xì)胞內(nèi)miRNA-145明顯升高（P<0.05），A549/L細(xì)胞內(nèi)miRNA-145明顯降低（P<0.05），而A549/E和A

5、549細(xì)胞相比差異無顯著性（P＞0.05）。
　　4.CCK8法實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：A549/H組，A549/E組及A549組細(xì)胞生長24h后，OD值分別為0.624、0.709、0.690；48h后，OD值分別為0.703、0.777、0.763；72h后，OD值分別為0.724、0.794、0.779；96h后，OD值分別為0.759、0.834、0.825。與A549組相比，A549/H組細(xì)胞在第24h，48h，72h，96h的細(xì)胞

6、OD值顯著降低。與A549組相比，A549/H組細(xì)胞增殖能力明顯減弱（P<0.05），而A549/E組和A549組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　5.Transwell腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：A549/H組，A549/E組及A549組三組細(xì)胞穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)為：A549/H組41個(gè)，A549/E組73個(gè)，A549細(xì)胞組81個(gè)。與A549組相比，A549/H組細(xì)胞侵襲能力顯著下降（P<0.05），而A549/E組和A5