鳥氨酸脫羧酶基因與乳腺癌細(xì)胞增殖侵襲關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、多胺在乳腺癌組織中有很高的表達(dá)濃度⑴。在乳腺癌組織中，多胺的濃度明顯的比正常對(duì)照組織中濃度高。并且多胺在腫瘤組織中的濃度與乳腺腫瘤的侵襲能力、組織學(xué)分級(jí)和Ki-67增殖指數(shù)有很密切的關(guān)系⑵。有人認(rèn)為ODC可以作為抑制腫瘤增殖、侵襲的靶標(biāo)，以往的報(bào)道中，多見以O(shè)DC不可逆抑制劑DFMO(二氟甲基鳥氨酸)抑制ODC活性防治腫瘤的研究，且在體外研究已證實(shí)可以抑制腫瘤的增殖，但由于DFMO細(xì)胞毒性較大，在臨床實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)較多的毒副作用，因而其應(yīng)用

2、前景令人失望。所以，以O(shè)DC為靶標(biāo)，探討新的治療方法，已經(jīng)引起較為廣泛的重視。山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究中心課題研究組已經(jīng)以O(shè)DC為靶標(biāo)采用反義RNA技術(shù)對(duì)前列腺癌，大腸癌等進(jìn)行基因治療的研究，并取得良好的效果，但采用這種技術(shù)對(duì)乳腺癌進(jìn)行基因治療的研究尚未見報(bào)道。因此，我們選擇乳腺癌為目標(biāo)，研究了腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的ODC基因的反義RNA對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用，為進(jìn)一步研究乳腺癌基因治療的方法提供理論依據(jù)和技術(shù)對(duì)策。為探討以O(shè)DC為靶標(biāo)

3、進(jìn)行反義基因治療的可行性，本研究首先采用RT-PCR和western blot方法檢測乳腺癌癌腫區(qū)及癌旁組織中ODC mRNA/蛋白的表達(dá)，并分析其與乳腺癌臨床分期(TNM分期)的關(guān)系。選取MCF-7，MDA-MB-231，MDA-MB-435，BT474等4種乳腺癌細(xì)胞系及MCF-10A正常乳腺上皮細(xì)胞，western blot比較ODC蛋白的表達(dá)。采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測ODC在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，MDA-M

4、B-231細(xì)胞同步化后，westernblot檢測MDA-MB-231細(xì)胞周期中ODC及cyclinD1蛋白的動(dòng)態(tài)表達(dá)。然后利用表達(dá)人ODC基因第三外顯子反義RNA重組腺病毒載體(rAd-ODC/Ex3as)，將ODC反義RNA轉(zhuǎn)入激素非依賴乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中，通過western blot分別檢測ODC和cyclinD1蛋白的表達(dá)量，MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測rAd-ODC/Ex3as對(duì)細(xì)胞生長增殖的作用。

5、流式細(xì)胞術(shù)檢測對(duì)細(xì)胞周期的影響。然后，通過細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染rAd-ODC/Ex3as后MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的改變。高效液相色譜法檢測rAd-ODC/Ex3as處理前后，MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)多胺濃度的變化。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過建立乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞裸鼠移植瘤模型來分析腺病毒rAd-ODC/Ex3as對(duì)腫瘤形成過程的作用?，F(xiàn)將本研究主要內(nèi)容簡要介紹如下。 第一部分：ODC基因在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

6、 方法：采用RT-PCR和western blot方法檢測乳腺癌癌腫區(qū)及癌旁組織中ODCmRNA和蛋白的表達(dá)，并分析其與乳腺癌臨床分期(TNM分期)的關(guān)系。ODCcDNA上游引物為5'-GCAGGATCCACCATGAA CAACTTTGGTAA-3'，下游引物為5'-GCCGAGATCTCAGAAGAAGAAACTTC-3'，均位于第三外顯子，擴(kuò)增片段為120bp；β-actin cDNA上游引物5’-GCGGATGTCCA CGT

7、CACACT-3’,下游引物為5’-CCACTGGCATGTGA TGGAC-3’，擴(kuò)增片段為428bp。選取MCF-7，MDA-MB-231，MDA-MB-435和BT474等4種乳腺癌細(xì)胞系及MCF-10A.正常乳腺上皮細(xì)胞，western blot檢測ODC蛋白的表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測ODC在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中定位表達(dá)情況，MDA-MB-231細(xì)胞同步化后，western blot檢測MDA-MB-231細(xì)胞周期

8、中ODC及cyclinD1蛋白動(dòng)態(tài)表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，利用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件的t檢驗(yàn)、秩相關(guān)分析對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。 結(jié)果： 1.癌腫組織中ODC mRNA和蛋白的表達(dá)水平普遍高于癌旁乳腺組織，且與乳腺癌臨床分期有關(guān)。 2.ER.陽性與ER陰性乳腺癌細(xì)胞系ODC蛋白表達(dá)無明顯差異，但ODC蛋白的表達(dá)在所有4種乳腺癌細(xì)胞系中均明顯高于正常乳腺上皮細(xì)胞。 3.MDA-MB-

9、231細(xì)胞中，ODC在靜息細(xì)胞內(nèi)表達(dá)較弱，主要表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，而在處于分裂期細(xì)胞中，ODC表達(dá)明顯增強(qiáng)，主要位于細(xì)胞核周圍。 4.細(xì)胞周期中，ODC第一個(gè)高峰發(fā)生在G1期，隨后伴隨多胺濃度的增高，在G2期有絲分裂前ODC出現(xiàn)第二個(gè)高峰℃yclin D1的表達(dá)也呈現(xiàn)周期性的變化。 結(jié)論： ODC基因在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)較正常細(xì)胞中明顯增高。在整個(gè)細(xì)胞周期過程中也存在ODC和cyclin D1的動(dòng)態(tài)變化。ODC有可能

10、作為一個(gè)乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，同時(shí)，以O(shè)DC為靶標(biāo)，研究乳腺癌的增殖及侵襲抑制作用，將對(duì)乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的預(yù)防及治療有較為重要的實(shí)際意義。 第二部分：ODC基因反義RNA對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲抑制作用的體外研究 方法：為研究鳥氨酸脫羧酶(ODC)基因反義RNA對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生長及侵襲抑制作用，將表達(dá)ODC第三外顯子反義RNA的重組腺病毒rAd-ODC/Ex3as感染乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231。采用western

11、blot方法檢測rAd-ODC/Ex3as對(duì)細(xì)胞中ODC和cyclin D1的表達(dá)抑制作用，流式細(xì)胞術(shù)檢測其對(duì)細(xì)胞周期的影響。通過MTT法和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響。并確定合適的感染滴度，細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞遷移、侵襲能力的改變。最后通過高效液相色譜法檢測rAd-ODC/Ex3as處理前后，MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)多胺濃度的變化。 結(jié)果：1，以rAd-ODC/Ex3as感染MDA-MB-231細(xì)胞，可明顯

12、抑制該細(xì)胞中的ODC基因蛋白表達(dá)，抑制率為48.2％。同時(shí)，cyclin D1表達(dá)也明顯降低，抑制率55％。 2，以50 MOI rAd-ODC/Ex3as感染MDA-MB-231細(xì)胞，rAd-ODC/Ex3as使細(xì)胞周期停滯于G1期，可明顯抑制其生長增殖，最大抑制率為60％，軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)顯示，rAd-ODC/Ex3as感染MDA-MB-231細(xì)胞形成集落數(shù)量明顯減少。 3，細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)rAd-ODC/Ex3a

13、s可抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力。 4，rAd-ODC/Ex3as感染后，MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)三種多胺，尤其是腐胺的濃度明顯降低。 [結(jié)論] rAd-ODC/Ex3as在體外能有效地干擾ODC基因的表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)多胺的濃度，并使其細(xì)胞周期阻滯于G1期，從而抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖，并能降低MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲性，為進(jìn)一步基因治療的研究打下基礎(chǔ)。 第三部分：ODC

14、基因反義RNA對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長抑制作用的體內(nèi)研究[方法]檢測ODC基因反義RNA對(duì)已形成腫瘤的作用：收集MDA-MB-231細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×106/100ul，將100ul細(xì)胞懸液注射入裸鼠皮下，當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到5～7mm時(shí)，被隨機(jī)分組，瘤內(nèi)注射病毒3×109/pfu每5天注射一次，共3次，腫瘤體積每5天測量一次。 結(jié)果： 重組腺病毒rAd-ODC/Ex3as對(duì)已形成的裸鼠乳腺癌移植瘤，能夠減緩其生長，治療后15天

15、rAd-ODC/Ex3as組與其他兩組體積比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜O.05)。即治療后15天后rAd-ODC/Ex3as處理組腫瘤體積增長速度較對(duì)照組和空載體組明顯減慢。 結(jié)論] 通過研究重組腺病毒rAd-ODC/Ex3as對(duì)移植瘤模型的作用，結(jié)果顯示ODC反義RNA對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖有抑制作用，可以使已形成的皮下乳腺腫瘤減緩生長，從而，將對(duì)其局部及遠(yuǎn)處侵襲有一定的抑制作用。 通過RT-PCR和western blot

16、方法分別檢測了乳腺癌組織和細(xì)胞系的ODC表達(dá)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析顯示癌腫組織中ODC的表達(dá)水平普遍高于癌旁乳腺組織，且與乳腺癌臨床分期有關(guān)。4種乳腺癌細(xì)胞系ODC蛋白的表達(dá)明顯高于正常乳腺上皮細(xì)胞。ODC基因反義RNA(rAd-ODC/Ex3as)能明顯抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中ODC基因的表達(dá)，從而使細(xì)胞內(nèi)多胺合成降低。流式細(xì)胞術(shù)顯示rAd-ODC/Ex3as使細(xì)胞周期停滯于G1期，軟瓊脂和MTT檢測顯示，細(xì)胞增殖受到明顯抑制。細(xì)胞

17、遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組腺病毒rAd-ODC/Ex3as能降低MDA-MB-231的侵襲性。在裸鼠皮下移植瘤模型中，ODC反義RNA可抑制乳腺腫瘤的生長。結(jié)果表明：rAd-ODC/Ex3as在乳腺癌細(xì)胞內(nèi)可以有效地干擾ODC基因的表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖，并降低MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲性和體內(nèi)腫瘤的形成與生長。提示ODC反義RNA在腫瘤防治中具有一定意義。該文系ODC基因反義RNA防治乳腺腫瘤的初步研究，為進(jìn)一步