含轉(zhuǎn)導(dǎo)域重組神經(jīng)肽PACAP-PTD對(duì)小鼠胸腺微環(huán)境及其功能細(xì)胞的作用研究.pdf

1、[目的]：
　　設(shè)計(jì)合成含轉(zhuǎn)導(dǎo)域的重組神經(jīng)肽PACAP-PTD(重組腺苷酸環(huán)化酶激活肽)，制備及純化PACAP-PTD和PACAP，比較其活性和穿生物屏障能力，檢測(cè)PACAP特異性受體PAC1在胸腺中的表達(dá);利用體外細(xì)胞損傷模型，確定及比較PACAP-PTD與PACAP對(duì)小鼠胸腺和脾臟淋巴細(xì)胞活性的作用;原代及傳代培養(yǎng)小鼠胸腺上皮細(xì)胞，建立胸腺上皮細(xì)胞與胸腺淋巴細(xì)胞的共培養(yǎng)模型，以期明確PACAP-PTD和PACAP對(duì)小鼠胸腺微環(huán)

2、境及功能細(xì)胞的作用。
　　[方法]：
　　原核表達(dá)系統(tǒng)及蛋白內(nèi)含肽介導(dǎo)的重組PACAP-PTD及PACAP的高效制備、純化，鑒定及其生物活性和穿生物屏障能力的比較分析;免疫組化鑒定PACAP特異性受體PAC1在小鼠機(jī)體胸腺表達(dá);western blotting檢測(cè)不同性別、年齡小鼠胸腺細(xì)胞中PAC1的表達(dá);利用D半乳糖、環(huán)磷酰胺、地塞米松建立并篩選體外淋巴細(xì)胞損傷模型;新型細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑(CCK8)比色法及Ann

3、exinⅤ-FITC/PI流式雙染檢測(cè)地塞米松對(duì)胸腺、脾臟淋巴細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)及胸腺淋巴細(xì)胞與胸腺上皮細(xì)胞共培養(yǎng)各個(gè)加藥組細(xì)胞活性的作用;組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行原代胸腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)，觀察不同時(shí)間細(xì)胞形態(tài)的變化;利用波形蛋白和角蛋白進(jìn)行免疫組化鑒定;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡;酶聯(lián)免疫法測(cè)定相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。
　　[結(jié)果]：
　　1.所制備的目的蛋白PACAP-PTD通過(guò)激光飛行質(zhì)譜儀測(cè)定其分子量，發(fā)現(xiàn)結(jié)果與理論值相符;PACAP-PT

4、D與PACAP保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞SHSY5Y增殖活性實(shí)驗(yàn)，PACAP-PTD組細(xì)胞存活率為0.931±0.091，PACAP組的存活率為0.884±0.083;PACAP-PTD對(duì)血腦、氣血、血睪、血胸腺生物屏障的穿膜效率分別為28.07±2.556、20.72±2.353、4.83±0.764、27.05±2.087，相對(duì)應(yīng)的PACAP穿膜效率為17.23±1.603、9.26±1.872、1.56±0.324、9.78±0.953;

5、>　　2.免疫組化鑒定受體分布發(fā)現(xiàn)PACAP的特異受體PAC1在小鼠胸腺內(nèi)有陽(yáng)性表達(dá)，并主要分布在胸腺上皮細(xì)胞和胸腺細(xì)胞;隨著小鼠年齡的變化，PACAP特異性受體PAC1的表達(dá)與胸腺指數(shù)的變化呈代償性負(fù)相關(guān);
　　3.不同藥物對(duì)淋巴細(xì)胞作用篩選細(xì)胞損傷模型的研究中發(fā)現(xiàn)地塞米松對(duì)胸腺淋巴細(xì)胞、脾臟淋巴細(xì)胞的增殖活性均有抑制作用，瓊脂糖凝膠電泳分析加藥組存在細(xì)胞凋亡;
　　4.PACAP-PTD及PACAP對(duì)胸腺和脾臟淋巴細(xì)胞都

6、具有促增殖和和抑凋亡的作用，且PACAP-PTD的效果比PACAP更為明顯;
　　5.貼壁法培養(yǎng)胸腺上皮細(xì)胞，免疫組化抗角蛋白顯示表達(dá)陽(yáng)性、抗波形蛋白顯示表達(dá)陰性，可鑒定為上皮細(xì)胞;
　　6.細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)淋巴細(xì)胞的作用研究中發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，共培養(yǎng)組細(xì)胞的存活率顯著增加，凋亡率降低;共培養(yǎng)體系中，PACAP-PTD及PACAP加藥組的存活率提高，凋亡率降低;PACAP-PTD提升實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1(IL-1)、白細(xì)

7、胞介素4(IL-4)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)的分泌量，與對(duì)照組相比，IL-1、IL-4、TGF-beta1的PACAP-PTD組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　[結(jié)論]：
　　PACAP-PTD較PACAP具有更強(qiáng)的保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞SHSY5Y細(xì)胞增殖活性的作用;PACAP-PTD較PACAP能更有效地穿越小鼠的血腦、氣血和血睪屏障;PACAP-PTD與PACAP對(duì)小鼠胸腺淋巴細(xì)胞和脾