IκBαM重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建及其對大鼠自體原位肝移植膽道缺血再灌注損傷的保護(hù)作用.pdf

1、背景：肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥發(fā)生率高，是影響患者長期存活及導(dǎo)致移植物丟失的最主要原因之一，因此肝移植后膽道并發(fā)癥的防治是進(jìn)一步提高移植受體存活率和遠(yuǎn)期療效的關(guān)鍵。移植肝膽管缺血再灌注損傷是肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的重要病因?qū)W因素，肝臟缺血再灌注損傷是早期多種炎性因子激活的結(jié)果。NF-κB作為一種普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的基因中起關(guān)鍵作用。研究肝膽管缺血再灌注損傷過程中NF-κB的作用，并以其為靶點(diǎn)的干預(yù)措施有可能對移植肝膽管缺血再灌注

2、損傷具有保護(hù)作用。本研究擬觀察腺相關(guān)病毒攜帶NF-κB超抑制物IκBαM(rAAV-IκBαM)對肝移植膽道缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。 第一部分大鼠自體原位肝移植膽道缺血再灌注損傷模型的建立及肝臟再灌注損傷中NF-κB激活的研究 目的:建立穩(wěn)定的大鼠自體原位肝移植膽道缺血再灌注損傷模型，觀察建立模型手術(shù)并發(fā)癥、存活率及肝臟缺血再灌注損傷中NF-κB的激活。 方法:門靜脈和腹主動脈雙重灌注法建立大鼠自體原位肝移植膽

3、道缺血再灌注損傷模型，將Weistar大鼠隨機(jī)分成兩組：肝移植膽道缺血再灌注損傷手術(shù)組(LT-IRI group)：行大鼠原位肝移植膽道缺血再灌注損傷；假手術(shù)組(Sham group，SH group)：僅行開腹和肝門區(qū)解剖手術(shù)；分別于術(shù)后12h，24h,72h，7d取肝組織行NF-κB免疫組化檢測，取外周血檢測肝臟酶學(xué)指標(biāo)。 結(jié)果:共進(jìn)行大鼠自體原位肝移植膽道缺血再灌注損傷模型80例，其中穩(wěn)定模型60例，穩(wěn)定模型期手術(shù)存活率約

4、90％，一周存活率約為81.7％。免疫組化顯示術(shù)后2hLT-IRI組NF-Bκ激活細(xì)胞明顯多于SH組；而其肝功能損傷指標(biāo)(外周血ALT)在各時(shí)點(diǎn)IX-IRI組均較SH組亦明顯增加，兩組比較具有明顯差異，以術(shù)后24h最為顯著(417.2±45.3 vs57.6±5.4)。 結(jié)論:成功建立大鼠自體原位肝移植膽道缺血再灌注損傷模型，無肝期約14±3 min。肝移植缺血再灌注過程中早期即有NF-κB的激活。 第二部分 IκBαM

5、基因重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建及鑒定 目的:構(gòu)建攜帶NF-κB超抑制物IκBαM基因的重組腺病毒載體。 方法:應(yīng)用BamHI和XhoII內(nèi)切酶雙酶切pAAV-MCS質(zhì)粒和PcDNA3.0-IκBαM，經(jīng)過膠回收和純化后，在T4連接酶作用下，構(gòu)建pAAV-MCS-IκBαM，酶切和測序鑒定，293細(xì)胞病毒包裝，重組腺病毒載體大量擴(kuò)增，病毒滴度的測定及濃縮純化。 結(jié)果:經(jīng)雙酶切和連接成重組質(zhì)粒pAAV-MCS-IκBα

6、M，雙酶切pAAV-MCS-IκBαM得到大小分別為6.4Kb和970bp的載體和目的基因片段；經(jīng)PCR鑒定得到大小為970bp的IκBαM片段；測序鑒定正確；經(jīng)測定分離濃縮和純化重組腺相關(guān)病毒獲得病毒滴度約為7×108pfu/ml～5×109pfu/ml。 結(jié)論:成功構(gòu)建IκBαM基因重組腺相關(guān)病毒載體，病毒濃縮純化滴度滿足實(shí)驗(yàn)要求。 第三部分 rAAV-IκBαM對大鼠自體原位肝移植膽道缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

7、 目的:觀察rAAV-IκBαM轉(zhuǎn)染肝臟術(shù)后肝內(nèi)NF-κB及其下游炎性分子的表達(dá)，膽管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和電鏡形態(tài)學(xué)變化情況，探討rAAV-IκBαM在大鼠肝移植膽道缺血再灌注損傷中的作用。 方法:將Weistar大鼠分為三組：假手術(shù)組(單純行開關(guān)腹手術(shù))，對照組(行肝移植膽道缺血再灌注損傷手術(shù))，rAAV-IκBαM轉(zhuǎn)染組(術(shù)前兩天行rAAV-IκBαM轉(zhuǎn)染)。分別于術(shù)后2h，24h，72h，7d取材。常規(guī)HE染色觀察肝外膽管和

8、肝組織學(xué)變化，用western blot檢測NF-κB p65的表達(dá)，RT-PCR測定肝組織中TNF-α、ICAM-1 mRNA的表達(dá)，免疫組化檢測TNF-α、ICAM-1的表達(dá)，ELESA檢測血清TNF-α的水平，各時(shí)點(diǎn)肝臟酶學(xué)的變化及膽管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和電鏡形態(tài)學(xué)變化。 結(jié)果:rAAV-IκBαM轉(zhuǎn)染組與對照組相比：NFκB p65于術(shù)后2h、24h表達(dá)具有顯著性差異，核內(nèi)蛋白水平明顯降低，72h后各時(shí)點(diǎn)NF-κB p65核

9、內(nèi)蛋白差異不明顯；術(shù)后2h、24h TNF-α及ICAM-1 mRNA的表達(dá)水平具有顯著性差異；免疫組化示TNF-α、ICAM-1于移植后24h、72h的表達(dá)具有顯著性差異；術(shù)后24h血清TNF-α具有顯著性差異；肝臟酶學(xué)指標(biāo)(ALT、GGT)在各時(shí)點(diǎn)具有顯著性差異，尤其在術(shù)后24h，72h最為顯著；術(shù)后2h、24h、72h膽管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡明顯減少；術(shù)后24h電鏡下膽管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷明顯減輕。各移植組與假手術(shù)組差異顯著。 結(jié)論