新布尼亞病毒河南分離株的分子特征及相關(guān)蛋白的表達(dá).pdf

1、發(fā)熱伴血小板減少綜合征(Fever，ThrombocytopeniaandLeukopeniaSyndrome，F(xiàn)TLS)是我省于2007年在信陽(yáng)首次發(fā)現(xiàn)的一種新發(fā)傳染病，新布尼亞病毒是其致病病原體。河南省作為該病的高發(fā)地區(qū)，近年報(bào)告病例逐年增多。本研究通過(guò)分析河南分離株新布尼亞病毒的分子特征，篩選出病毒相對(duì)保守的基因片段;針對(duì)病毒保守序列，表達(dá)、純化相關(guān)蛋白，建立相應(yīng)的血清學(xué)檢測(cè)方法，為該病的監(jiān)測(cè)和防控奠定基礎(chǔ)。
　　目的:

2、r>　　了解河南地區(qū)新布尼亞病毒的分子特征，掌握河南分離株的基因型特點(diǎn)。篩選病毒保守的核蛋白基因序列，構(gòu)建核蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)。表達(dá)、純化核蛋白并初步建立起針對(duì)抗核蛋白抗體的ELISA方法，為FTLS血清學(xué)檢測(cè)試劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　材料和方法:
　　通過(guò)FTLS專項(xiàng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)收集2011-2012年患者資料，對(duì)患者血清進(jìn)行病毒培養(yǎng)、分離和鑒定。對(duì)分離到的毒株進(jìn)行全基因組序列擴(kuò)增、測(cè)定。采用生物信息學(xué)軟件對(duì)所得序列進(jìn)行同源性

3、比較，篩選出病毒相對(duì)保守的基因序列，并與國(guó)內(nèi)其他分離株進(jìn)行比較、分析。根據(jù)分子特征分析結(jié)果鎖定保守的編碼病毒核蛋白序列，構(gòu)建核蛋白的原核表達(dá)載體，優(yōu)化表達(dá)條件、純化獲取融合蛋白。采用SDS-PAGE、Westernblot對(duì)融合蛋白進(jìn)行分析;建立間接ELISA方法對(duì)臨床血清樣本中的NP抗體進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　新布尼亞病毒經(jīng)培養(yǎng)后，病毒載量明顯增高，經(jīng)過(guò)序列測(cè)定和拼接后共獲得29株新布尼亞病毒的全基因組序列，其中201

4、1年10株，2012年19株。系統(tǒng)進(jìn)化和基因分型結(jié)果顯示2011-2012年新布尼亞病毒病毒分離株分布于A、B、E三個(gè)基因型中，2011年分離株以B型為主，2012年分離株以A型為主。序列同源性分析結(jié)果顯示29株河南分離株病毒基因組核苷酸同源性在95％～100％之間，編碼相應(yīng)蛋白的氨基酸同源性在96％～100％之間。新布尼亞病毒編碼核蛋白的序列高度保守，29株河南分離株核蛋白氨基酸同源性為99.2％～100％之間，僅1株發(fā)生變異。與國(guó)內(nèi)

5、其他分離株比較，核蛋白氨基酸同源性為100％。確定核蛋白序列為新布尼亞病毒的高度保守序列。
　　成功構(gòu)建了核蛋白的原核表達(dá)載體pMAL-c2x-NP。通過(guò)優(yōu)化表達(dá)條件獲得純化的融合蛋白，經(jīng)免疫印跡雜交證實(shí)重組蛋白具有抗原性。用建立的ELISA方法檢測(cè)96例疑似發(fā)熱伴血小板綜合癥臨床樣本陽(yáng)性率為40.6％，和qRT-PCR方法比較，兩者符合率為77.1％。
　　結(jié)論:
　　1、新布尼亞病毒河南分離株共有A、B、E三個(gè)基因