新布尼亞病毒河南分離株的分子特征及相關蛋白的表達.pdf

1、發(fā)熱伴血小板減少綜合征(Fever，ThrombocytopeniaandLeukopeniaSyndrome，FTLS)是我省于2007年在信陽首次發(fā)現的一種新發(fā)傳染病，新布尼亞病毒是其致病病原體。河南省作為該病的高發(fā)地區(qū)，近年報告病例逐年增多。本研究通過分析河南分離株新布尼亞病毒的分子特征，篩選出病毒相對保守的基因片段;針對病毒保守序列，表達、純化相關蛋白，建立相應的血清學檢測方法，為該病的監(jiān)測和防控奠定基礎。
　　目的:

2、r>　　了解河南地區(qū)新布尼亞病毒的分子特征，掌握河南分離株的基因型特點。篩選病毒保守的核蛋白基因序列，構建核蛋白的原核表達系統(tǒng)。表達、純化核蛋白并初步建立起針對抗核蛋白抗體的ELISA方法，為FTLS血清學檢測試劑的研發(fā)奠定基礎。
　　材料和方法:
　　通過FTLS專項監(jiān)測系統(tǒng)收集2011-2012年患者資料，對患者血清進行病毒培養(yǎng)、分離和鑒定。對分離到的毒株進行全基因組序列擴增、測定。采用生物信息學軟件對所得序列進行同源性

3、比較，篩選出病毒相對保守的基因序列，并與國內其他分離株進行比較、分析。根據分子特征分析結果鎖定保守的編碼病毒核蛋白序列，構建核蛋白的原核表達載體，優(yōu)化表達條件、純化獲取融合蛋白。采用SDS-PAGE、Westernblot對融合蛋白進行分析;建立間接ELISA方法對臨床血清樣本中的NP抗體進行檢測。
　　結果:
　　新布尼亞病毒經培養(yǎng)后，病毒載量明顯增高，經過序列測定和拼接后共獲得29株新布尼亞病毒的全基因組序列，其中201

4、1年10株，2012年19株。系統(tǒng)進化和基因分型結果顯示2011-2012年新布尼亞病毒病毒分離株分布于A、B、E三個基因型中，2011年分離株以B型為主，2012年分離株以A型為主。序列同源性分析結果顯示29株河南分離株病毒基因組核苷酸同源性在95％～100％之間，編碼相應蛋白的氨基酸同源性在96％～100％之間。新布尼亞病毒編碼核蛋白的序列高度保守，29株河南分離株核蛋白氨基酸同源性為99.2％～100％之間，僅1株發(fā)生變異。與國內

5、其他分離株比較，核蛋白氨基酸同源性為100％。確定核蛋白序列為新布尼亞病毒的高度保守序列。
　　成功構建了核蛋白的原核表達載體pMAL-c2x-NP。通過優(yōu)化表達條件獲得純化的融合蛋白，經免疫印跡雜交證實重組蛋白具有抗原性。用建立的ELISA方法檢測96例疑似發(fā)熱伴血小板綜合癥臨床樣本陽性率為40.6％，和qRT-PCR方法比較，兩者符合率為77.1％。
　　結論:
　　1、新布尼亞病毒河南分離株共有A、B、E三個基因