新布尼亞病毒檢測(cè)方法設(shè)計(jì)及其致病機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的：發(fā)熱伴血小板減少綜合征(SFTS)是近年來(lái)一種新發(fā)的病毒感染性疾病，它的主要病原體由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心（CDC）在2010年發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)為發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒（SFTSV），亦稱(chēng)新布尼亞病毒。SFTS疑似患者血清陽(yáng)性檢出率在70％左右。對(duì)于因 SFTSV感染引起的SFTS，目前沒(méi)有有效的疫苗可供使用也無(wú)特異性治療手段，主要為對(duì)癥支持療法，因此快速、敏感、特異的檢測(cè)診斷尤為重要。目前新布尼亞病毒 RNA的檢測(cè)方法主要是熒

2、光RT-PCR。熒光RT-PCR是20世紀(jì)90年代末發(fā)展起來(lái)的一種檢測(cè)方法，與常規(guī)RT-PCR、ELISA等檢測(cè)方法相比具有操作簡(jiǎn)單、實(shí)時(shí)快速、定性定量、特異敏感、重復(fù)性好、不易污染、高通量等優(yōu)點(diǎn)，是目前各種病毒檢測(cè)診斷的主要方法。雖然熒光RT-PCR具有上述優(yōu)點(diǎn)，但針對(duì)發(fā)熱伴血小板減少綜合征病人血清中新布尼亞病毒的檢測(cè)敏感性不甚理想。因此研究建立比熒光RT-PCR更為敏感的檢測(cè)方法，以早期確診新布尼亞病毒是SFTS早期診治的關(guān)鍵突破點(diǎn)

3、。新布尼亞病毒感染的臨床表現(xiàn)以發(fā)熱，血小板和（或）白細(xì)胞進(jìn)行性下降、胃腸道反應(yīng)、肝酶及心肌酶譜升高，臟器出血、多臟器功能損傷等為主要特征，部分患者可繼發(fā)嗜血細(xì)胞綜合征（HPS），死亡率在12%~30%。但目前對(duì)SFTSV繼發(fā)嗜血細(xì)胞綜合征的報(bào)道較少。本臨床研究旨在分析SFTSV感染繼發(fā)HPS患者的臨床特征、骨髓細(xì)胞學(xué)變化及預(yù)后，進(jìn)一步揭示SFTSV感染的特征性癥狀白細(xì)胞和（或）血小板降低的原因，提出早期臨床干預(yù)措施，提高生存率。

4、　　方法：⑴采用簡(jiǎn)套式熒光RT-PCR方法，PCR反應(yīng)中利用兩套PCR引物（1對(duì)外套引物和1對(duì)內(nèi)套引物）進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增的方法，即將外套引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物作為內(nèi)套引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的模板，內(nèi)套引物與模板DNA的結(jié)合位點(diǎn)處于外套引物擴(kuò)增出的DNA片段上游，提取待檢樣品RNA，設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，按照配置好的反應(yīng)體系，用外引物（P1、P2）進(jìn)行一步法RT-PCR，以上述一步法RT-PCR產(chǎn)物為模板，將內(nèi)引物（P3、P4）及探針

5、和反應(yīng)組分置于熒光PCR儀中進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)。⑵選取2012.5-2016.7在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬舟山醫(yī)院感染性疾病科所有確診SFTSV感染且行骨髓穿刺細(xì)胞學(xué)檢查患者，其中符合SFTS繼發(fā)HPS診斷的患者共25例納入研究，分析其臨床特征、骨髓細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)以及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)、預(yù)后，并分析SFTSV感染引起血小板、白細(xì)胞下降是否與其繼發(fā)HPS相關(guān)，采用Fisher統(tǒng)計(jì)分析SFTS繼發(fā)HPS是否是其死亡的危險(xiǎn)因素。
　　結(jié)果：①簡(jiǎn)套式熒光

6、RT-PCR與熒光RT-PCR對(duì)4個(gè)新布尼亞病毒核酸平行檢測(cè)結(jié)果曲線與Ct值比較：A=13 a=27 B=16 b=32 C=19.6 c=34.2 D=22.1 d=37.1。②新布尼亞病毒可觀察到明顯的熒光增加信號(hào)（典型的S型擴(kuò)增曲線），而Hanta病毒、甲型H1N1流感病毒、H3N2流感病毒、乙型流感病毒、腸道病毒EV71型、柯薩奇病毒A16和陰性對(duì)照均未觀察到熒光增加信號(hào)曲線。簡(jiǎn)套式RT-PCR檢測(cè)下限為0.3拷貝/μL，比熒光

7、RT-PCR敏感性提高100倍。結(jié)果不同核酸濃度各自的檢測(cè)Ct值標(biāo)準(zhǔn)差（SD）在0.11—0.21之間，變異系數(shù)（cv）在0.43%—0.94%之間，說(shuō)明本方法具有良好的重復(fù)性。3.25例患者均表現(xiàn)有發(fā)熱、乏力、納差，部分表現(xiàn)為肌肉酸痛，消化道癥狀，少數(shù)患者出現(xiàn)神經(jīng)精神癥狀。25例患者均有白細(xì)胞及血小板下降，ALT、AST、CK、LDH、D-D升高，F(xiàn)IB下降。骨髓細(xì)胞學(xué)檢查中，25例患者均出現(xiàn)了程度不等的嗜血現(xiàn)象，以巨噬細(xì)胞吞噬紅細(xì)胞

8、和血小板較常見(jiàn)。HPS組和非HPS組比較，兩組死亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：⑴本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的新布尼亞病毒檢測(cè)新方法--簡(jiǎn)套式熒光 RT-PCR，既保留了熒光PCR的實(shí)時(shí)快速、不易污染、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)又吸收了套式PCR的高度敏感、高度特異的特點(diǎn)，對(duì)于SFTSV-RNA檢測(cè)較熒光RT-PCR敏感性提高100倍，具有良好的敏感性、特異性和重復(fù)性。⑵新布尼亞病毒感染繼發(fā)嗜血細(xì)胞綜合征患者臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，HPS是SFTS的重