糖尿病早期血管內(nèi)皮功能受損與ox-LDL及其受體表達的關系及羅格列桐的干預作用.pdf

1、最新的流行病學統(tǒng)計表明，目前我國糖尿病( diabetes mellitus，DM)患病率約為9.7％，我國DM患者約9240萬人，已成為DM患者總數(shù)最多的國家。2型糖尿病(type2 diabetes mellitus，T2DM)的特點是糖脂代謝紊亂，高血糖、高血脂和胰島素抵抗互為因果，導致內(nèi)皮功能障礙及動脈硬化( atherosclerosis，AS)的發(fā)生和發(fā)展。從DM的發(fā)病前期到發(fā)展為DM、DM終末期，血糖逐漸升高，胰島素的分泌

2、經(jīng)歷了代償性的分泌增加至分泌相對不足和最終胰島功能衰竭幾個階段。肝臟是重要的脂代謝器官，并且作為糖原合成、儲存和釋放的器官在維持血糖平衡上起重要作用，DM時由于糖脂代謝紊亂合并存在，臨床上糖尿病人較正常人更多的合并有脂肪肝。DM的主要危害是血管并發(fā)癥——AS，可涉及全身多個器官。然而，在出現(xiàn)AS臨床表現(xiàn)之前，DM初期甚至糖耐量異常期人群，已存在血管內(nèi)皮細胞功能障礙，表現(xiàn)為內(nèi)皮素(endothelin，ET)、一氧化氮(nitricoxi

3、de，NO)等物質(zhì)的分泌異常，內(nèi)皮依賴性血管舒張功能的下降，以及脈膊波傳導速度的變化等，同時血液中的一些諸如氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)、胰島素水平、血脂等的異常均可對血管內(nèi)皮功能的改變起到作用。Henry等研究表明糖耐量異常與股動脈和肱動脈僵硬度升高相關，提示在T2DM發(fā)生以前已經(jīng)存在有動脈彈性的下降。我們之前的研究顯示糖耐量異常期及DM初期患者的血流介導的內(nèi)皮依

4、賴性血管舒張功能即出現(xiàn)下降，提示患者已存在有早期AS。因此，早期發(fā)現(xiàn)DM人群甚至糖耐量異常人群的AS，對其進行早期干預治療有可能在臨床上取得更好的療效，并具有重大意義。
　　 DM引起大血管、微血管病變的發(fā)病機制，目前認為是多種危險因素作用于不同環(huán)節(jié)所導致的多因素疾病。而這些因素（如長期慢性高血糖、高胰島素血癥、脂肪代謝紊亂等）之間可能存在復雜的交互作用，促成了DM狀態(tài)下血管病變，即AS的發(fā)生、發(fā)展。內(nèi)皮細胞分泌的ET與NO是具

5、有拮抗作用的血管活性物質(zhì)，NO/ET的失衡可促進AS的發(fā)生。內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelia nitric oxide synthase，eNOS)是一氧化氮合成的關鍵酶，在維持血管正常功能中起著重要的作用，是重要的抗AS因子，其表達水平的變化是影響內(nèi)皮產(chǎn)生具有舒血管活性的NO的重要因素。ox-LDL是在體內(nèi)由低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)進入動脈壁后被內(nèi)皮細胞、巨噬細胞等生成的氧自由基及

6、酶類氧化而成，是一種重要的致AS因子，與DM并發(fā)癥有密切聯(lián)系，可做為臨床上T2DM病人血管并發(fā)癥的早期預測因子。而血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體1(lectin like oxidized low density lipoprotein receptor-1，LOX-1)的主要功能是介導血管內(nèi)皮細胞攝取ox-LDL，使內(nèi)皮細胞功能發(fā)生損傷。研究表明，LOX-1的表達異常是血管內(nèi)皮細胞功能異常的最早期標志，在粘附分子產(chǎn)生及AS形成中起重要

7、作用。
　　 噻唑烷二酮類藥物（thiazolidinediones， TZDs）做為胰島素增敏劑可改善與胰島素抵抗(insulin resistance，IR)相關的代謝紊亂，在臨床上被廣泛應用，并可直接作用于血管內(nèi)的過氧化物酶體增殖活化受體γ(proliferators-actived receptorγ，PPARγ)，發(fā)揮其血管保護作用，這些作用包括糾正血管重塑和內(nèi)皮功能紊亂，抑制血管細胞的增殖和遷移，抑制炎癥因子的產(chǎn)生和

8、損傷及增強粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性等。深入研究TZDs在血管保護方面的作用對DM及其并發(fā)癥和心血管疾病的防治有重要意義。
　　 綜上所述，本研究通過臨床和動物實驗對于T2DM早期血管病變進行從功能至器質(zhì)性變化的觀察，從血清葡萄糖、胰島素、膽固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、ET、NO、ox-LDL的變化，到主動脈、肝臟、胰腺組織的光鏡下病理學變化，并進一步深入至LOX-1、PPARγ、eNOS的蛋白和mRNA表達，從多方面、

9、多層次進行研究，并應用TZDs進行干預治療觀察上述指標變化情況。又從臨床上探討上述血清學指標與脈搏波傳導速度和內(nèi)皮依賴性血管舒張功能的關系。對于今后臨床上T2DM血管并發(fā)癥的早期發(fā)現(xiàn)和防治意義重大。
　　 第一部分2型糖尿病大鼠血清ox-LDL、ET、NO的改變及羅格列酮的干預作用
　　 目的：通過制備2型糖尿病的動物模型，分析血清ox-LDL水平變化與ET、NO改變的關系，并了解羅格列酮的干預作用。
　　 方法

10、：7周齡雄性Wistar大鼠80只，適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為對照組、高脂組、糖尿病組、羅格列酮治療組（糖尿病+羅格列酮治療）各20只。對照組以普通飲食飼養(yǎng)，高脂組、糖尿病組和羅格列酮組均以高脂飲食飼養(yǎng)4周后，對糖尿病組和羅格列酮治療組以小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射制備2型糖尿病大鼠模型。2周后39只成模（糖尿病組死亡1只），羅格列酮治療組予羅格列酮灌胃治療。于糖尿病成模后6周和12周時處死部分動物取血進行血糖、血脂、胰島素、氧化型低密度脂

11、蛋白(ox-LDL)、內(nèi)皮素(ET)、一氧化氮(NO)的檢測，比較各組間指標變化及各組自身前后的指標變化。
　　 結果：
　　 1糖尿病成模后6周和12周，與對照組相比，羅格列酮治療組、糖尿病組血糖升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)；高脂組血糖雖然高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。與對照組比較，高脂組、糖尿病組及羅格列酮治療組的CHO、TG、LDL-C水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。高脂組

12、和糖尿病組的CHO、TG、LDL-C在12周時較6周時升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)；羅格列酮治療組CHO和LDL-C在12周時較6周時升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)；羅格列酮治療組血糖、TG、HDL-C前后比較無明顯變化(p＞0.05)。
　　 2 糖尿病成模后6周時：與對照組比較，高脂組、糖尿病組和羅格列酮治療組空腹胰島素水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，與高脂組比較，糖尿病組和羅格列酮治療組空腹

13、胰島素水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)；糖尿病組胰島素水平高于羅格列酮治療組，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。糖尿病成模后12周時：糖尿病組胰島素水平較對照組、高脂組和羅格列酮治療組升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)；對照組、高脂組和羅格列酮治療組胰島素水平無統(tǒng)計學差異(p＞0.05）。糖尿病組12周時胰島素水平6周時升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)；羅格列酮治療組12周時胰島素水平較6周時下降，差異有統(tǒng)計學意義(

14、p＜0.01)。
　　 3 糖尿病成模后6周時：與對照組比較，高脂組、糖尿病組和羅格列酮治療組ox-LDL升高，分別為22.30士3.75ug/L，27.48士0.64ug/L，25.83士6.96ug/L，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)；糖尿病組及羅格列酮治療組ox-LDL較高脂組略有升高，但無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。糖尿病成模后12周時：糖尿病組ox-LDL較對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)；糖尿病組ox-

15、LDL較高脂組和羅格列酮治療組略有升高，但無統(tǒng)計學差異，(p＞0.05)；對照組、高脂組和羅格列酮治療組間比較無差異(p＞0.05)。高脂組12周時ox-LOX較6周時升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)；對照組、糖尿病組和羅格列酮治療組12周時ox-LDL較6周時升高，但無統(tǒng)計學意義(p＞0.05）。
　　 4 糖尿病成模后6周時，與對照組比較，高脂組、糖尿病組及羅格列酮治療組ET升高，分別為51.90士14.20μg/L，

16、60.32±11.83μg/L，54.13士7.80μg/L，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)；而三組間ET比較無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。12周時與對照組比較，高脂組、糖尿病組及羅格列酮治療組ET升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)；與高脂組比較，糖尿病組ET升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)；與羅格列酮治療組比較，糖尿病組ET升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。各組自身ET水平在6周時與12周時比較無明顯變化(p＞0.0

17、5）。
　　 5 糖尿病成模后6周和12周時，與對照組比較，高脂組、糖尿病組及羅格列酮治療組NO降低，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)；而6周時三組間NO比較無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。12周時與高脂組比較，糖尿病組NO降低，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）；與羅格列酮治療組比較，糖尿病組NO降低，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。糖尿病組自身NO水平在12周時與6周時比較下降，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)；對照組、高脂組

18、和羅格列酮治療組自身NO水平在6周時與12周時比較無明顯變化(p＞0.05)。
　　 結論：
　　 1 糖尿病組大鼠較高脂飲食組大鼠表現(xiàn)出更明顯的糖脂代謝紊亂，且隨時間延長程度加重。
　　 2 無論是糖尿病組還是高脂飲食組大鼠致動脈硬化因子ox-LDL、ET升高，預防動脈硬化的保護因子NO下降，并隨時間延長有加重趨勢。
　　 3 羅格列酮可一定程度改善T2DM大鼠的脂代謝紊亂、IR，降低AS致病因子ox-

19、LOX、ET，改善NO/ET失衡。
　　 第二部分2型糖尿病大鼠主動脈、肝臟、胰腺形態(tài)學變化及羅格列酮的干預作用
　　 目的：觀察2型糖尿病大鼠在成模后6周和12周時主動脈、肝臟、胰腺的病理學變化，以及羅格列酮的干預作用。
　　 方法：動物分組、造模和干預同第一部分，于糖尿病成模后6周和12周時留取動物肝臟、胰腺、主動脈進行HE染色，在光鏡下觀察各組動物不同組織的病理學。
　　 結果：
　　 16

20、周時對照組、高脂組、糖尿病組及羅格列酮治療組大鼠主動脈未見明顯病理改變。12周對照組大鼠動脈壁未見明顯病理改變；高脂組大鼠主動脈內(nèi)皮不連續(xù)，但彈力纖維及平滑肌細胞排列尚整齊，未見浸潤的淋巴細胞等病理改變；糖尿病組大鼠主動脈的內(nèi)皮細胞不連續(xù)，平滑肌細胞和彈力纖維排列紊亂，內(nèi)膜增厚，內(nèi)皮下間隙增寬，內(nèi)皮細胞表面可見浸潤的淋巴細胞；羅格列酮治療組亦存在不同程度病理改變程度，但較糖尿病組減輕。
　　 26周時對照組大鼠肝細胞未見明顯病理

21、改變；糖尿病組及高脂組可見部分肝細胞脂肪變性，細胞內(nèi)可見大小不一脂肪滴，肝細胞結構尚清晰；羅格列酮治療組肝細胞結構較清晰，小部分細胞脂肪變性，細胞內(nèi)可見大小不一脂肪滴，但程度較糖尿病組減輕。12周時對照組大鼠肝組織及細胞未見明顯病理改變。高脂組大鼠肝細胞排列欠規(guī)則，細胞明顯脂肪變性，細胞可見大小不一的脂肪滴形成，部分肝細胞的細胞核變小，固縮。糖尿病組大鼠這種病變表現(xiàn)更明顯，肝組織結核及肝細胞排列紊亂，絕大部分肝細胞存在大泡性脂肪滴，細胞

22、核大小不一，部分顯示不清，部分固縮；羅格列酮治療組大鼠的肝細胞仍存在脂肪變性，但情況較高脂組和糖尿病組明顯減輕。
　　 36周時對照組、高脂組大鼠胰島形態(tài)結構完整、清晰，胰腺腺泡之間可見散在分布淺粉色胰島細胞團，呈圓形或橢圓形，胰島中心部位可見較多數(shù)量的β細胞，而糖尿病組和羅格列酮治療組大鼠胰島結構完整性破壞，胰島中心部位β細胞數(shù)量減少。12周時對照組大鼠胰島未見明顯病理改變；高脂組胰島結構尚完整，淺粉色胰島細胞團散在分布，但胰

23、島中心β細胞數(shù)量略有減少；糖尿病組胰島周圍組織完整性破壞，胰島細胞團數(shù)量減少，體積變小，胰島中心β細胞數(shù)量減少，細胞胞質(zhì)著色淺，空泡增多，細胞核固縮。羅格列酮治療組上述情況有所改善，胰島細胞團體積較糖尿病組大，胰島中心β細胞數(shù)量均較糖尿病組多，僅見小部分細胞核固縮。
　　 結論：
　　 1 糖尿病造模成功后予羅格列酮治療6周時光鏡下觀察，高脂組和糖尿病組大鼠主動脈形態(tài)學改變不明顯，但高脂組肝臟發(fā)生病理學變化，糖尿病組和羅

24、格列酮治療組的肝臟和胰腺形態(tài)學均已發(fā)生病理變化。
　　 2 糖尿病造模成功后予羅格列酮治療12周時光鏡下觀察，高脂組、糖尿病大鼠主動脈、胰腺和肝臟均發(fā)生病理改變。
　　 3 羅格列酮治療組上述病變呈不同程度減輕，考慮作用可能與其改善胰島素抵抗及糖脂代謝紊亂有關。
　　 第三部分2型糖尿病大鼠肝臟及主動脈的LOX-1、eNOS、PPARγ蛋白和mRNA表達及羅格列酮的干預作用
　　 目的：觀察2型糖尿病大鼠

25、成模后6周、12周氧化型低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)、內(nèi)皮型一氧化氮酶(eNOS)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)在主動脈和肝臟的蛋白，以及主動脈的mRNA表達，并觀察羅格列酮對表達的影響。
　　 方法：動物分組、造模和干預同第一部分，于糖尿病成模后6周和12周時留取動物肝臟、主動脈組織進行LOX-1、eNOS、PPARγ的蛋白表達，主動脈的mRNA表達檢測，觀察比較各組動物的表達差異。
　　 結果：<

26、br>　　 1 糖尿病成模后6周和12周時，與對照組和高脂組比較，糖尿病組和羅格列酮治療組主動脈LOX-1的蛋白表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);6周時高脂組主動脈LOX-1的蛋白表達較對照組上調(diào)，但無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；6周時羅格列酮治療組較糖尿病組主動脈LOX-1的蛋白表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；6周時羅格列酮治療組較高脂組主動脈LOX-1的蛋白表達上調(diào)，但無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。高脂組、糖

27、尿病組和羅格列酮治療組12周時與6周時比較主動脈LOX-1的蛋白表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
　　 2 糖尿病成模后6周和12周時，與對照組比較，高脂組、糖尿病組和羅格列酮治療組主動脈eNOS的蛋白表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);糖尿病組較高脂組和羅格列酮治療組主動脈eNOS的蛋白表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);羅格列酮治療組較高脂組主動脈eNOS的蛋白表達下調(diào)，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0

28、.05）。糖尿病組和羅格列酮治療組主動脈12周時與6周時比較eNOS的蛋白表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 3 糖尿病成模后6周和12周時，與對照組比較，高脂組、糖尿病組和羅格列酮治療組主動脈PPARγ的蛋白表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；糖尿病組較高脂組和羅格列酮治療組PPARγ的蛋白表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 4 糖尿病成模后6周時，糖尿病組大鼠肝臟較對照組和高脂

29、組的LOX-1表達上調(diào)；12周時，高脂組、糖尿病組和羅格列酮治療組肝臟的LOX-1表達均較對照上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05），糖尿病組和羅格列酮治療組較高脂組的LOX-1表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);6周和12周時羅格列酮治療組肝臟LOX-1較糖尿病組表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 5 糖尿病成模后6周和12周時，與對照組比較，高脂組、糖尿病組和羅格列酮治療組肝臟eNOS表達下調(diào)，差異有

30、統(tǒng)計學意義(p＜0.01)；與高脂比較，糖尿病組和羅格列酮治療組的eNOS表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01);12周時羅格列酮治療組較糖尿病組肝臟的eNOS表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
　　 6 糖尿病成模后6周和12周時，與對照組比較，高脂組、糖尿病組和羅格列酮治療組的PPARγ表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；糖尿病組和羅格列酮治療組較高脂組的PPARγ表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.0

31、1);羅格列酮組較糖尿病組的的PPARγ表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 7 糖尿病成模后6周和12周時，與對照組比較，高脂組、糖尿病組和羅格列酮治療組主動脈LOX-1的mRNA表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與高脂組比較，糖尿病組和羅格列酮治療組主動脈LOX-1的mRNA表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；羅格列酮治療組較糖尿病組LOX-1的mRNA表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01

32、)。
　　 8 糖尿病成模后6周和12周時，與對照組比較，高脂組、糖尿病組和羅格列酮治療組主動脈eNOS的mRNA表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；與高脂組比較，糖尿病組和羅格列酮治療組主動脈eNOS的mRNA表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；羅格列酮治療組較糖尿病組eNOS的mRNA表達上調(diào)，但無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　 9 糖尿病成模后6周和12周時，與對照組比較，高脂組、糖尿病組和羅格

33、列酮治療組主動脈PPARγ的mRNA表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；與高脂組比較，糖尿病組和羅格列酮治療組主動脈PPARγ的mRNA表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，P＜0.05；羅格列酮治療組較糖尿病組PPARγ的mRNA表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 結論：
　　 1 高血糖、高血脂均可導致大鼠肝臟及主動脈LOX-1、eNOS和PPARγ的蛋白表達異常，以及主動脈的mRNA表

34、達異常，且高血糖和高血脂合并存在時其表達異常更明顯。
　　 2 LOX-1、eNOS和PPARγ蛋白和mRNA表達異常發(fā)生于動脈硬化病理改變之前。
　　 3 噻唑烷二酮類藥物對這種表達的紊亂有一定逆轉(zhuǎn)作用，從而發(fā)揮其抗炎、抗AS作用。
　　 第四部分高血糖人群早期血管功能改變及相關因素探討
　　 目的：采用血管外超聲技術及動脈硬化測定儀評價高血糖人群早期血管功能的改變，并探討其相關影響因素。
　　

35、 方法：選取糖耐量異常者45例，初診2型糖尿病者40例，年齡35～45歲，除外心腦血管疾病及其它疾病。另選取健康體檢者30例做為對照組。分別測量身高、體重、血壓，檢測空腹血糖、餐后血糖、血脂、ox-LDL、ET，應用高分辨率超聲檢測肱動脈對反應性充血的舒張反應，應用動脈硬化測定儀測定其脈搏波傳導速度，比較三組人群各項指標差異，并分析其相關性。
　　 結果：糖尿病組和糖耐量異常組體重指數(shù)顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.0

36、5)，但糖尿病組與糖耐量異常組比較體重指數(shù)無統(tǒng)計學差異（p＞0.05）。糖尿病組、糖耐量異常組和對照組收縮壓、舒張壓、脈壓比較無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。脈搏波傳導速度從對照組至糖耐量異常組、糖尿病組依次升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。內(nèi)皮依賴性血管舒張功能從對照組至糖耐異常組、糖尿病組依次降低，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)?？崭寡?、餐后血糖、膽固醇、甘油三脂、內(nèi)皮素和ox-LDL從對照組至糖耐異常組、糖尿病組依次升高，

37、差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)?？崭寡?、餐后血糖、脈壓差、收縮壓、ET、內(nèi)皮依賴性血管舒張功能、ox-LDL與脈搏波傳導速度相關，相關系數(shù)分別為r=0.743,0.762,0.807,0.759,0.774,0.790,0.822。
　　 結論：
　　 1 糖耐量異常期和DM初期即存在早期AS，表現(xiàn)為血管內(nèi)皮功能受損及血管壁彈性下降，應予以早期干預。
　　 2 內(nèi)皮素和氧化型低密度蛋白可以做為動脈硬化的早期預