桂枝芍藥知母湯對(duì)CIA大鼠Toll樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用和機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis RA)是一種以關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)周圍組織的非感染性炎癥為主的異質(zhì)性、系統(tǒng)性、慢性自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)腫痛、強(qiáng)直、畸形和功能障礙為主要臨床表現(xiàn)。具體癥狀表現(xiàn)為雙手、腕和足關(guān)節(jié)的對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎，亦可累及膝、髖等大關(guān)節(jié)。RA的病因至今未明，目前仍屬一種難治性疾病，尚無特異有效根治本病的療法和藥物，誤診率高、不合理用藥率較高、致殘率高，而中醫(yī)藥治療因?yàn)槠涓弊饔幂^小、并

2、且在緩解疼痛、提高患者生存質(zhì)量方面有著較好的效果而具有一定的優(yōu)勢(shì)。
　　 研究基礎(chǔ)：
　　 滑膜炎是RA的基本病理表現(xiàn)，TLR是存在于細(xì)胞上介導(dǎo)炎性介質(zhì)產(chǎn)生的重要受體，其主導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在宿主防御反應(yīng)中起到了關(guān)鍵的作用，特別是在作為連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁時(shí)顯然異常重要。然而TLR的過度表達(dá)及活化將導(dǎo)致嚴(yán)重的機(jī)體免疫功能紊亂。目前人們做了大量的研究證明了TLR異?；罨閷?dǎo)的炎癥反應(yīng)與RA的發(fā)病及進(jìn)展，尤其是

3、滑膜炎癥的發(fā)生發(fā)展和進(jìn)展有著密不可分的聯(lián)系。
　　 研究目標(biāo)：
　　 RA隸屬中醫(yī)學(xué)“痹癥”之中“歷節(jié)病”的范疇。仲景祖師早在千年前就認(rèn)識(shí)到了其存在。其對(duì)歷節(jié)病病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)、辨證施治的方法和所創(chuàng)立的針對(duì)性方劑桂枝芍藥知母湯至今仍在指導(dǎo)著臨床實(shí)踐。本研究通過文獻(xiàn)尋找桂枝芍藥知母湯治療RA的理論基礎(chǔ)，并建立Ⅱ型膠原誘導(dǎo)動(dòng)物RA模型，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察桂枝芍藥知母湯對(duì)Toll樣受體細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)指標(biāo)作用的研究分析，探索

4、其治療RA的作用機(jī)理。為桂枝芍藥知母湯治療RA提供更深層次的客觀依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 理論研究：通過回顧桂枝芍藥知母湯的組方意義、臨床應(yīng)用以及歷代醫(yī)家對(duì)RA病名、病因、病機(jī)的認(rèn)識(shí)、相關(guān)臨床實(shí)踐及實(shí)驗(yàn)研究，探討RA以《金匱要略》理論基礎(chǔ)為指導(dǎo)，從歷節(jié)病論治，并使用桂枝芍藥知母湯治療可能性和可靠性。
　　 實(shí)驗(yàn)部分以CIA大鼠為受試對(duì)象，觀察桂枝芍藥知母湯煎劑對(duì)CIA模型鼠關(guān)節(jié)評(píng)分、關(guān)節(jié)體積、關(guān)節(jié)腫脹度及關(guān)

5、節(jié)病理組織學(xué)的影響，使用SP免疫組化法、酶聯(lián)免疫吸附法、蛋白質(zhì)印跡法和PCR法對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠滑膜組織中的相關(guān)指標(biāo)：炎性細(xì)胞因子IL-1、IL-6、IL-17及TNF-α，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，接頭蛋白MyD88，Toll樣受體2、4、9以及TLR逆調(diào)控因子SIGIRR進(jìn)行了檢測(cè)，從細(xì)胞、蛋白及基因三個(gè)層面揭示桂枝芍藥知母湯對(duì)RA治療的作用機(jī)理。
　　 研究結(jié)果：
　　 從病因病機(jī)、癥狀及治法分析得出RA可以從歷節(jié)病論治，實(shí)驗(yàn)

6、顯示桂枝芍藥知母湯水煎劑對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹有一定的抑制作用，能減輕關(guān)節(jié)滑膜的增生程度及關(guān)節(jié)軟骨的損傷程度。桂枝芍藥知母湯各劑量組分別不同程度的表現(xiàn)出了對(duì)CIA大鼠滑膜組織中TLR2、TLR4、TLR9、MyD88、NF-κB、IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α表達(dá)的抑制作用，CIA大鼠模型組滑膜組織中SIGIRR的表達(dá)較空白對(duì)照組有所降低，而桂枝芍藥知母湯高、低劑量組SIGIRR的表達(dá)卻明顯高于模型組。
　　 研究結(jié)論

7、：
　　 ①RA可以從“歷節(jié)”病論治。
　　 ②桂枝芍藥知母湯可以明顯減輕CIA模型大鼠足腫脹度、降低關(guān)節(jié)評(píng)分并減輕關(guān)節(jié)病理組織改變。
　　 ③TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和RA的發(fā)病相關(guān)。
　　 ④桂枝芍藥知母湯對(duì)TLR信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)有抑制作用，并可能藉此減輕RA炎癥反應(yīng)，起到緩解病情的作用。
　　 ⑤TLR信號(hào)通路負(fù)調(diào)控因子的被抑制可能導(dǎo)致在RA滑膜炎的發(fā)生或進(jìn)展。
　　 ⑥桂枝芍

8、藥知母湯可能可以通過激活TLR信號(hào)通路負(fù)調(diào)控因子SIGIRR的表達(dá)來起到抑制TLR信號(hào)通路所介導(dǎo)的RA滑膜炎癥反應(yīng)的作用。
　　 研究創(chuàng)新：
　　 使用多種技術(shù)手段（SP免疫組化、酶聯(lián)免疫吸附、蛋白質(zhì)印跡及PCR法）對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠滑膜組織中的多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)，從細(xì)胞、蛋白及基因三個(gè)層面揭示桂枝芍藥知母湯治療RA的作用機(jī)理。被檢測(cè)指標(biāo)涵蓋了Toll樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的多個(gè)重要位點(diǎn)，且重要指標(biāo)采用不同技術(shù)路線進(jìn)行了重復(fù)檢驗(yàn)，具