益氣活血復(fù)方對(duì)Toll樣受體4及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響及抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　 動(dòng)脈粥樣硬化（atherosderosis，AS）是一種復(fù)雜的多因素疾病，內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎癥機(jī)制在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中起著極為重要的作用。最近研究表明，非感染性甚至感染性因素引起的炎癥反應(yīng)和免疫系統(tǒng)的活化貫穿于AS的始終。但是，炎癥因子及免疫反應(yīng)與AS在分子機(jī)制上的關(guān)系尚不明了。因此，深入研究AS的炎癥和免疫機(jī)制，探討阻斷AS的發(fā)病途徑具有重要意義。免疫系統(tǒng)的基本功能是識(shí)別外源性抗原，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一系列免

2、疫反應(yīng)以清除外源性致病物質(zhì)，保持機(jī)體的穩(wěn)定。已知人類通過(guò)固有性免疫（先天性免疫）和適應(yīng)性免疫（獲得性免疫）兩個(gè)免疫識(shí)別系統(tǒng)來(lái)抵御體內(nèi)外各種有害物質(zhì)。適應(yīng)性免疫系統(tǒng)特異性識(shí)別環(huán)境中存在的獨(dú)特抗原決定簇。固有性免疫是機(jī)體抵御各種微生物和有害物質(zhì)的第一道屏障，識(shí)別被稱為病原相關(guān)分子模式（PAMP）的高度保守抗原域。近年研究表明介導(dǎo)先天免疫和炎癥反應(yīng)的受體Toll樣受體4（TLR4）參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。TLR4與特異性自身配體結(jié)合后

3、，通過(guò)髓樣分化因子88（MyD88）依賴性或非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活下游一系列蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，導(dǎo)致核因子-k B、活化蛋白-1、干擾素調(diào)節(jié)因子等重要免疫基因轉(zhuǎn)錄因子的活化，從而誘導(dǎo)相應(yīng)細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素（IL-l、IL-2）、腫瘤壞死因子-a（TNF-a）及干擾素的合成與釋放，并通過(guò)促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟來(lái)啟動(dòng)獲得性免疫反應(yīng)，最終激發(fā)一系列針對(duì)不同病原微生物的免疫事件。目前對(duì)TLR4在AS中的作用機(jī)制的研究才剛剛

4、開(kāi)始，TLR4與MyD88依賴性或MyD88非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在AS發(fā)生和發(fā)展中的機(jī)制尚不明確。因此，深入研究TLR4及MyD88依賴性或非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在AS發(fā)生和發(fā)展中的作用及其相關(guān)機(jī)制，不僅為我們進(jìn)一步研究AS的發(fā)病機(jī)制提供了一個(gè)新的角度，而且在治療和預(yù)防AS方面也提出了新的思路。
　　 隨著對(duì)AS研究的不斷深入和越來(lái)越多炎癥相關(guān)因子的相繼發(fā)現(xiàn)，AS的炎癥反應(yīng)學(xué)說(shuō)被普遍接受。在動(dòng)脈粥樣硬化的早期，白細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋

5、巴細(xì)胞等與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、遷移是最重要的始動(dòng)環(huán)節(jié)。單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附、跨內(nèi)皮遷移、內(nèi)膜巨噬細(xì)胞的聚集、平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)的聚集等多個(gè)環(huán)節(jié)均依賴于粘附分子（如VCAM-1、ICAM-1等）的作用。研究表明細(xì)胞因子（TNF-a和IL-1β）增加單核細(xì)胞和冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的粘附是通過(guò)VCAM-1和ICAM-1的作用，證明TNF-a可引起VCAM-1和ICAM-1表達(dá)的升高。研究表明氧化低密度脂蛋白（ox-LDL

6、）作為致動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，主要通過(guò)其特異性受體-血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體1（LOX-1）結(jié)合、攝取及降解并介導(dǎo)其生物學(xué)功能。已證實(shí)TLR4與LOX-1共同表達(dá)于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)皮細(xì)胞中。研究表明LPS是TLR4的特異性配體，LPS可通過(guò)TLR4/NF-KB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上調(diào)LOX-1的表達(dá)，增加ox-LDL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，加速動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。因此，抑制LOX-1、TNF-a、ICAM-1的表達(dá)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展

7、有明顯的抑制作用。
　　 治療方面，已報(bào)道了多種具有抗AS作用的藥物，大量研究表明他汀類藥物存在多效性作用，成為當(dāng)前最有效的治療AS的藥物之一。然而，他汀類藥物抑制AS發(fā)生和發(fā)展的機(jī)理尚未完全闡明，另外，他汀類藥物長(zhǎng)期應(yīng)用可產(chǎn)生明顯不良反應(yīng)，這在一定程度上限制了他汀類藥物的臨床應(yīng)用。由于AS形成因素復(fù)雜，治療AS的候選藥物應(yīng)能抑制AS的多個(gè)環(huán)節(jié)。而中藥化學(xué)成分的多樣性和生物活性的廣泛性，為有效防治AS提供了理論上的可行性，其多環(huán)

8、節(jié)、多靶點(diǎn)治療AS且穩(wěn)定性好，不良反應(yīng)輕等特點(diǎn)，日益受到關(guān)注，有望使該病的治療取得新的進(jìn)展。近年來(lái)，多種中藥已經(jīng)被用于防治AS及其相關(guān)疾病，并顯示出良好的作用，但中藥與現(xiàn)代新型抗AS藥物療效的對(duì)比以及中藥治療AS的分子生物學(xué)機(jī)制研究尚不明確。深入研究中醫(yī)藥對(duì)TLR4及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的生物學(xué)特性及其調(diào)控機(jī)制的影響以及對(duì)LOX-1、FNF-a及ICAM-1表達(dá)的影響，從細(xì)胞和分子水平開(kāi)展前瞻性的實(shí)驗(yàn)研究，有可能開(kāi)發(fā)出靶點(diǎn)特異、高效的TL

9、R4拮抗藥物，可望為AS的中醫(yī)藥治療及其機(jī)制研究提供新的切入點(diǎn)。
　　 目的：
　　 采用血清藥理學(xué)方法研究益氣活血復(fù)方對(duì)TLR4及其下游MyD88依賴性通路及非依賴性通路的影響及對(duì)LOX-1、TNF-a、ICAM-1表達(dá)的影響，探討益氣活血復(fù)方防治動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、20只新西蘭大耳白兔，隨機(jī)分為空白組、中藥高、中、低濃度組，每組5只，分別以生理鹽水和高、中、低濃度益氣活血復(fù)方

10、灌胃，每日一次，連續(xù)7天。于末次灌胃給藥2h后，心臟采血，離心后抽取上清液，合并同組含藥血清，并用0.22μm一次性濾器無(wú)菌過(guò)濾，置-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>　　 2、取健康嬰兒新鮮臍帶，在無(wú)菌條件下，用胰酶消化法分離人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，在37℃、5％CO2條件下傳代培養(yǎng)，并用第Ⅷ因子相關(guān)抗原進(jìn)行鑒定。
　　 3、體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，隨機(jī)分為6組，即正常組，模型組，西藥對(duì)照組，中藥高、中、低濃度組，用LPS（1μg/

11、ml）刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，激活TLR4及下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并用不同濃度益氣活血復(fù)方含藥血清和阿托伐他汀進(jìn)行干預(yù)，24h后收集細(xì)胞。用Real time PCR方法和Western blot方法分別檢測(cè)TLR4、MyD88、TRAF-6、TRAM、TRIF及NF-KB mRNA和蛋白表達(dá)。
　　 4、用LPS（1μg/ml）刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，激活LOX-1、TNF-a及ICAM-1，并用不同濃度益氣活血復(fù)方含藥血清和阿托伐他

12、汀進(jìn)行干預(yù)，24h后收集細(xì)胞。用Real time PCR方法和Western blot方法分別檢測(cè)LOX-1、TNF-a及ICAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、離心后獲得的含藥血清為淡黃色、澄清液體，每50ml血液大約可獲得20-25ml血清。實(shí)驗(yàn)共獲得4組血清，即空白對(duì)照組血清、益氣活血高濃度組含藥血清、益氣活血中濃度組含藥血清和益氣活血低濃度組含藥血清。
　　 2、培養(yǎng)到融合狀態(tài)的細(xì)胞

13、呈單層“鋪路石”樣排列，用第Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)細(xì)胞為第Ⅷ因子相關(guān)抗原陽(yáng)性。
　　 3、經(jīng)LPS刺激24h以后，模型組細(xì)胞TLR4及下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要元件MyD88、TRAF-6及NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高（與空白對(duì)照組比較P<0.01）；經(jīng)藥物干預(yù)后各治療組細(xì)胞TLR4、MyD88、TRAF-6及NF-κB mRNA和蛋白明顯下降，其中西藥對(duì)照組效果最為明顯（與模型組比較P<0.01）；3個(gè)中

14、藥組均對(duì)TLR4、MyD88、TRAF-6及NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)有明顯的抑制作用（與模型組比較P<0.01或P<0.05），其中中藥高濃度組在3個(gè)濃度組當(dāng)中效果最好。
　　 4、經(jīng)LPS刺激24h以后，模型組細(xì)胞TLR4下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要元件TRAM及TRIFmRNA表達(dá)明顯升高（與空白對(duì)照組比較P<0.01）；經(jīng)藥物干預(yù)后各治療組細(xì)胞TRAM及TRIF mRNA表達(dá)無(wú)明顯下降（與模型組比較P>0.05）。
　

15、　 5、經(jīng)LPS刺激24h以后，模型組細(xì)胞LOX-1、TNF-α及ICAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高（與空白對(duì)照組比較P<0.01）；經(jīng)藥物干預(yù)后各治療組細(xì)胞LOX-1、TNF-α及ICAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯下降，其中西藥對(duì)照組效果最為明顯（與模型組比較P<0.01）：3個(gè)中藥組均對(duì)LOX-1、TNF-α及ICAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)有明顯的抑制作用與模型組比較P<0.01或P<0.05），其中中藥高濃度組在3個(gè)濃

16、度組當(dāng)中效果最好。
　　 結(jié)論：
　　 1、經(jīng)上述方法可獲得含不同濃度藥物的含藥血清，為下一步體外干預(yù)實(shí)驗(yàn)提供了原材料。
　　 2、采用胰蛋白酶消化法可從人臍靜脈分離出內(nèi)皮細(xì)胞，用人第Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化法檢測(cè)，證明所獲得的是內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 3、LPS可激活TLR4及其下游MyD88依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要元件MyD88、TRAF-6和NF-KBmRNA和蛋白表達(dá)，干預(yù)24h后益氣活血復(fù)方可抑制TLR4

17、、MyD88、TRAF-6和NF-KB mRNA和蛋白表達(dá)，說(shuō)明益氣活血復(fù)方可抑制TLR4及其下游MyD88依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要元件mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　 4、LPS可激活TLR4下游MyD88非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要元件TRAM和TRIF mRNA表達(dá)，干預(yù)24h后益氣活血復(fù)方對(duì)TRAM和TRIF mRNA表達(dá)無(wú)明顯的抑制作用，說(shuō)明益氣活血復(fù)方對(duì)MyD88非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路沒(méi)有抑制作用。
　　 5、LPS可激