益氣活血復(fù)方對Toll樣受體4及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響及抗動脈粥樣硬化的機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 動脈粥樣硬化（atherosderosis，AS）是一種復(fù)雜的多因素疾病，內(nèi)皮細胞損傷、炎癥機制在動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中起著極為重要的作用。最近研究表明，非感染性甚至感染性因素引起的炎癥反應(yīng)和免疫系統(tǒng)的活化貫穿于AS的始終。但是，炎癥因子及免疫反應(yīng)與AS在分子機制上的關(guān)系尚不明了。因此，深入研究AS的炎癥和免疫機制，探討阻斷AS的發(fā)病途徑具有重要意義。免疫系統(tǒng)的基本功能是識別外源性抗原，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生一系列免

2、疫反應(yīng)以清除外源性致病物質(zhì)，保持機體的穩(wěn)定。已知人類通過固有性免疫（先天性免疫）和適應(yīng)性免疫（獲得性免疫）兩個免疫識別系統(tǒng)來抵御體內(nèi)外各種有害物質(zhì)。適應(yīng)性免疫系統(tǒng)特異性識別環(huán)境中存在的獨特抗原決定簇。固有性免疫是機體抵御各種微生物和有害物質(zhì)的第一道屏障，識別被稱為病原相關(guān)分子模式（PAMP）的高度保守抗原域。近年研究表明介導(dǎo)先天免疫和炎癥反應(yīng)的受體Toll樣受體4（TLR4）參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。TLR4與特異性自身配體結(jié)合后

3、，通過髓樣分化因子88（MyD88）依賴性或非依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活下游一系列蛋白級聯(lián)反應(yīng)，將刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞核內(nèi)，導(dǎo)致核因子-k B、活化蛋白-1、干擾素調(diào)節(jié)因子等重要免疫基因轉(zhuǎn)錄因子的活化，從而誘導(dǎo)相應(yīng)細胞因子如白細胞介素（IL-l、IL-2）、腫瘤壞死因子-a（TNF-a）及干擾素的合成與釋放，并通過促進樹突狀細胞的成熟來啟動獲得性免疫反應(yīng)，最終激發(fā)一系列針對不同病原微生物的免疫事件。目前對TLR4在AS中的作用機制的研究才剛剛

4、開始，TLR4與MyD88依賴性或MyD88非依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在AS發(fā)生和發(fā)展中的機制尚不明確。因此，深入研究TLR4及MyD88依賴性或非依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在AS發(fā)生和發(fā)展中的作用及其相關(guān)機制，不僅為我們進一步研究AS的發(fā)病機制提供了一個新的角度，而且在治療和預(yù)防AS方面也提出了新的思路。
　　 隨著對AS研究的不斷深入和越來越多炎癥相關(guān)因子的相繼發(fā)現(xiàn)，AS的炎癥反應(yīng)學(xué)說被普遍接受。在動脈粥樣硬化的早期，白細胞、單核細胞和淋

5、巴細胞等與血管內(nèi)皮細胞的粘附、遷移是最重要的始動環(huán)節(jié)。單核細胞與血管內(nèi)皮細胞粘附、跨內(nèi)皮遷移、內(nèi)膜巨噬細胞的聚集、平滑肌細胞的遷移和增殖以及細胞外基質(zhì)的聚集等多個環(huán)節(jié)均依賴于粘附分子（如VCAM-1、ICAM-1等）的作用。研究表明細胞因子（TNF-a和IL-1β）增加單核細胞和冠狀動脈平滑肌細胞的粘附是通過VCAM-1和ICAM-1的作用，證明TNF-a可引起VCAM-1和ICAM-1表達的升高。研究表明氧化低密度脂蛋白（ox-LDL

6、）作為致動脈粥樣硬化的獨立危險因素，主要通過其特異性受體-血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體1（LOX-1）結(jié)合、攝取及降解并介導(dǎo)其生物學(xué)功能。已證實TLR4與LOX-1共同表達于動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)皮細胞中。研究表明LPS是TLR4的特異性配體，LPS可通過TLR4/NF-KB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上調(diào)LOX-1的表達，增加ox-LDL對內(nèi)皮細胞的損傷，加速動脈粥樣硬化的進程。因此，抑制LOX-1、TNF-a、ICAM-1的表達對動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展

7、有明顯的抑制作用。
　　 治療方面，已報道了多種具有抗AS作用的藥物，大量研究表明他汀類藥物存在多效性作用，成為當前最有效的治療AS的藥物之一。然而，他汀類藥物抑制AS發(fā)生和發(fā)展的機理尚未完全闡明，另外，他汀類藥物長期應(yīng)用可產(chǎn)生明顯不良反應(yīng)，這在一定程度上限制了他汀類藥物的臨床應(yīng)用。由于AS形成因素復(fù)雜，治療AS的候選藥物應(yīng)能抑制AS的多個環(huán)節(jié)。而中藥化學(xué)成分的多樣性和生物活性的廣泛性，為有效防治AS提供了理論上的可行性，其多環(huán)

8、節(jié)、多靶點治療AS且穩(wěn)定性好，不良反應(yīng)輕等特點，日益受到關(guān)注，有望使該病的治療取得新的進展。近年來，多種中藥已經(jīng)被用于防治AS及其相關(guān)疾病，并顯示出良好的作用，但中藥與現(xiàn)代新型抗AS藥物療效的對比以及中藥治療AS的分子生物學(xué)機制研究尚不明確。深入研究中醫(yī)藥對TLR4及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的生物學(xué)特性及其調(diào)控機制的影響以及對LOX-1、FNF-a及ICAM-1表達的影響，從細胞和分子水平開展前瞻性的實驗研究，有可能開發(fā)出靶點特異、高效的TL

9、R4拮抗藥物，可望為AS的中醫(yī)藥治療及其機制研究提供新的切入點。
　　 目的：
　　 采用血清藥理學(xué)方法研究益氣活血復(fù)方對TLR4及其下游MyD88依賴性通路及非依賴性通路的影響及對LOX-1、TNF-a、ICAM-1表達的影響，探討益氣活血復(fù)方防治動脈粥樣硬化的機制。
　　 方法：
　　 1、20只新西蘭大耳白兔，隨機分為空白組、中藥高、中、低濃度組，每組5只，分別以生理鹽水和高、中、低濃度益氣活血復(fù)方

10、灌胃，每日一次，連續(xù)7天。于末次灌胃給藥2h后，心臟采血，離心后抽取上清液，合并同組含藥血清，并用0.22μm一次性濾器無菌過濾，置-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>　　 2、取健康嬰兒新鮮臍帶，在無菌條件下，用胰酶消化法分離人臍靜脈內(nèi)皮細胞，在37℃、5％CO2條件下傳代培養(yǎng)，并用第Ⅷ因子相關(guān)抗原進行鑒定。
　　 3、體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞，隨機分為6組，即正常組，模型組，西藥對照組，中藥高、中、低濃度組，用LPS（1μg/

11、ml）刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞，激活TLR4及下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并用不同濃度益氣活血復(fù)方含藥血清和阿托伐他汀進行干預(yù)，24h后收集細胞。用Real time PCR方法和Western blot方法分別檢測TLR4、MyD88、TRAF-6、TRAM、TRIF及NF-KB mRNA和蛋白表達。
　　 4、用LPS（1μg/ml）刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞，激活LOX-1、TNF-a及ICAM-1，并用不同濃度益氣活血復(fù)方含藥血清和阿托伐他

12、汀進行干預(yù)，24h后收集細胞。用Real time PCR方法和Western blot方法分別檢測LOX-1、TNF-a及ICAM-1 mRNA和蛋白表達。
　　 結(jié)果：
　　 1、離心后獲得的含藥血清為淡黃色、澄清液體，每50ml血液大約可獲得20-25ml血清。實驗共獲得4組血清，即空白對照組血清、益氣活血高濃度組含藥血清、益氣活血中濃度組含藥血清和益氣活血低濃度組含藥血清。
　　 2、培養(yǎng)到融合狀態(tài)的細胞

13、呈單層“鋪路石”樣排列，用第Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)細胞為第Ⅷ因子相關(guān)抗原陽性。
　　 3、經(jīng)LPS刺激24h以后，模型組細胞TLR4及下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要元件MyD88、TRAF-6及NF-κB mRNA和蛋白表達明顯升高（與空白對照組比較P<0.01）；經(jīng)藥物干預(yù)后各治療組細胞TLR4、MyD88、TRAF-6及NF-κB mRNA和蛋白明顯下降，其中西藥對照組效果最為明顯（與模型組比較P<0.01）；3個中

14、藥組均對TLR4、MyD88、TRAF-6及NF-κB mRNA和蛋白表達有明顯的抑制作用（與模型組比較P<0.01或P<0.05），其中中藥高濃度組在3個濃度組當中效果最好。
　　 4、經(jīng)LPS刺激24h以后，模型組細胞TLR4下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要元件TRAM及TRIFmRNA表達明顯升高（與空白對照組比較P<0.01）；經(jīng)藥物干預(yù)后各治療組細胞TRAM及TRIF mRNA表達無明顯下降（與模型組比較P>0.05）。
　

15、　 5、經(jīng)LPS刺激24h以后，模型組細胞LOX-1、TNF-α及ICAM-1 mRNA和蛋白表達明顯升高（與空白對照組比較P<0.01）；經(jīng)藥物干預(yù)后各治療組細胞LOX-1、TNF-α及ICAM-1 mRNA和蛋白表達明顯下降，其中西藥對照組效果最為明顯（與模型組比較P<0.01）：3個中藥組均對LOX-1、TNF-α及ICAM-1 mRNA和蛋白表達有明顯的抑制作用與模型組比較P<0.01或P<0.05），其中中藥高濃度組在3個濃

16、度組當中效果最好。
　　 結(jié)論：
　　 1、經(jīng)上述方法可獲得含不同濃度藥物的含藥血清，為下一步體外干預(yù)實驗提供了原材料。
　　 2、采用胰蛋白酶消化法可從人臍靜脈分離出內(nèi)皮細胞，用人第Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化法檢測，證明所獲得的是內(nèi)皮細胞。
　　 3、LPS可激活TLR4及其下游MyD88依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要元件MyD88、TRAF-6和NF-KBmRNA和蛋白表達，干預(yù)24h后益氣活血復(fù)方可抑制TLR4

17、、MyD88、TRAF-6和NF-KB mRNA和蛋白表達，說明益氣活血復(fù)方可抑制TLR4及其下游MyD88依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要元件mRNA和蛋白的表達。
　　 4、LPS可激活TLR4下游MyD88非依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要元件TRAM和TRIF mRNA表達，干預(yù)24h后益氣活血復(fù)方對TRAM和TRIF mRNA表達無明顯的抑制作用，說明益氣活血復(fù)方對MyD88非依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路沒有抑制作用。
　　 5、LPS可激