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
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文檔簡介
1、胰腺癌是惡性度很高的腫瘤,近年來胰腺癌的發(fā)病率有逐年上升的趨勢,目前已經(jīng)成為美國第四位的腫瘤死因。因為缺少有效地治療手段,胰腺癌患者生存期短,生活質(zhì)量差,5年總生存率<5%,中位生存期僅有6個月。
胰腺癌的發(fā)病機制復雜,目前認為是由一系列基因突變引起的。已發(fā)現(xiàn)多條信號通路參與其發(fā)生和發(fā)展過程。因為胰腺癌易早期發(fā)生轉(zhuǎn)移,常轉(zhuǎn)移至肝、腹腔等部位,因此晚期胰腺癌患者的轉(zhuǎn)移成為目前胰腺癌晚期治療的一個重點。目前已知多個信號分子參與
2、腫瘤的轉(zhuǎn)移,包括趨化因子(chemokine)通路、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)通路等,而對這些信號通路的深入研究有助于了解胰腺癌轉(zhuǎn)移的機制并為后續(xù)靶向治療奠定基礎(chǔ)。
ARHI基因是1999年發(fā)現(xiàn)的一個母源性印跡基因,是Ras超家族成員之一,其編碼的蛋白在人類多種組織中表達,但在乳腺癌、卵巢癌及胰腺癌中卻存在表達下調(diào),多個研究提示ARHI是一個抑癌基因。
我們實驗室的前期研究表明ARHI基因在胰腺癌組織中也發(fā)
3、揮抑癌基因的作用。ARHI基因在正常胰腺組織廣泛表達,但在胰腺癌組織(47.8%)和細胞(8/8)中表達下調(diào)或缺失。通過瞬時和多克隆穩(wěn)定轉(zhuǎn)染將ARHI基因?qū)氡磉_缺失的胰腺癌細胞中,研究發(fā)現(xiàn)ARHI可抑制胰腺癌細胞的增殖,導致細胞周期停滯。
目前尚沒有文獻報道已建立ARHI的單克隆穩(wěn)定細胞株。本課題在前期已經(jīng)建立ARHI多克隆胰腺癌穩(wěn)定細胞株的基礎(chǔ)上嘗試建立單克隆的胰腺癌穩(wěn)定細胞株,為后續(xù)深入研究ARHI功能打下基礎(chǔ),并同
4、時初步探討ARHI穩(wěn)定表達是否會影響胰腺癌轉(zhuǎn)移信號通路。
第一部分 ARHI基因轉(zhuǎn)染胰腺癌PANC-1細胞單克隆穩(wěn)定株的建立方法:應用我們實驗室構(gòu)建的攜帶ARHI基因編碼序列的。pIRES2-ARHI-EGFP質(zhì)粒以及新構(gòu)建的慢病毒質(zhì)粒pLNCX2-ARHI-EGFP,采用脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染胰腺癌PANC-1細胞系,用G418篩選4周后挑選發(fā)綠色熒光的單克隆細胞,擴大培養(yǎng)后用RT-PCR及western blot驗證ARHI
5、基因轉(zhuǎn)錄及翻譯情況。單克隆穩(wěn)定株建立后分別用MTT法和細胞劃痕實驗研究ARHI對胰腺癌細胞增殖和遷移的影響。
研究結(jié)果:瞬時轉(zhuǎn)染48小時后ARHI組可見ARHI基因mRNA表達,而空載體組及正常PANC-1細胞組無ARHI mRNA表達;ARHI組瞬時轉(zhuǎn)染后24小時、48小時和72小時均可見ARHI蛋白表達,且24小時表達量最大,正常PANC-1細胞組和空載體組無ARHI蛋白表達;G418篩選4周后可見綠色團簇狀細胞,經(jīng)單
6、克隆篩選后可篩選出全部發(fā)綠色熒光的PANC-1細胞;RT-PCR和western blot檢測單克隆穩(wěn)定細胞株均能表達ARHI,而多克隆空載體組及正常PANC-1組無ARHI的表達;單克隆穩(wěn)定株中,ARHI可抑制胰腺癌細胞的增殖,在4-5天時與空載體組相比有明顯的差異性(P<0.05);細胞劃痕實驗顯示第12小時、24小時和48小時,ARHI組細胞遷移速率比空載體組減慢,具有顯著性差異(P<0.01),和PANC-1對照組相比遷移速率也
7、減慢,同樣具有顯著性差異(P<0.01)。
小結(jié):1)使用普通質(zhì)粒(pIRES2-EGFP)和慢病毒質(zhì)粒(pLNCX2)成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達ARHI的單克隆PANC-1細胞株;2)單克隆穩(wěn)定株中穩(wěn)定表達的ARHI可抑制胰腺癌PANC-1細胞的增殖和遷移。
第二部分體外實驗初探抑癌基因ARHI對胰腺癌轉(zhuǎn)移信號通路的影響方法:應用已經(jīng)建立的ARHI單克隆穩(wěn)定株,通過Real-time PCR檢測ARHI對趨化因子(
8、CXCL1、CXCL8)以及VEGF通路(VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C和HIFα)mRNA表達量的影響;通過免疫細胞化學染色觀察ARHI對細胞內(nèi)VEGF表達量的影響。
研究結(jié)果:和空載體組相比,單克隆穩(wěn)定表達ARHI組的CXCL1、CXCL8的mRNA表達量顯著低于前者,具有顯著性差異(P<0.05);單克隆穩(wěn)定表達ARHI組的VEGF-A、VEGF-B和HIFα的mRNA表達量高于空載體組,具有顯著性差異(P
9、<0.05),而VEGF-C的mRNA水平在兩者間沒有差異(P>0.05);用VEGF單克隆抗體對ARHI單克隆穩(wěn)定株進行免疫細胞化學染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)VEGF的表達量和空載體組相比無顯著性差異(P>0.05).
小結(jié):1)單克隆穩(wěn)定株中ARHI可抑制趨化因子CXCL1和CXCL8 mRNA的表達;2)單克隆穩(wěn)定株中ARHI可能促進VEGF-A、VEGF-B和HIFα mRNA的表達。
結(jié)論:
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