茭白黑粉菌二型態(tài)轉(zhuǎn)換的影響因素分析及乙醛酸循環(huán)關(guān)鍵基因功能初探.pdf

1、茭白黑粉菌(Ustilago esculenta)是茭白體內(nèi)的一種內(nèi)生真菌,其共生能引起茭白莖基部膨大,形成可食用的水生蔬菜—茭白。茭白田間有三種表型:正常茭白、灰茭及雄茭,三種表型與茭白黑粉菌在茭白體內(nèi)的生長(zhǎng)狀態(tài)密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),分離自正常茭白莖部的黑粉菌主要以菌絲狀形態(tài)存在,呈M-T(mycelia-teliospore)型,而分離自灰茭的黑粉菌主要以孢子形態(tài)存在,呈 T(teliospore)型。目前兩種茭白黑粉菌的研究主要集中

2、在形態(tài)和蛋白組差異方面,本文系統(tǒng)分析了培養(yǎng)基成分、pH值、溫度等對(duì)茭白黑粉菌體外培養(yǎng)時(shí)形態(tài)變化的影響;克隆獲得了2個(gè)乙醛酸循環(huán)途徑關(guān)鍵基因的全長(zhǎng)序列,比較分析了其在茭白黑粉菌形態(tài)變化中的差異表達(dá);構(gòu)建了茭白黑粉菌遺傳轉(zhuǎn)化體系,并對(duì)克隆獲得的基因進(jìn)行了初步的功能鑒定。
　　(1)分別采用7種碳源、8種氮源、10種碳氮比組合、4種不同 pH值的培養(yǎng)基培養(yǎng)分離自龍茭2號(hào)的 M-T型和 T型茭白黑粉菌,同時(shí)使用PDA培養(yǎng)基在20℃、28℃

3、、37℃培養(yǎng)兩種茭白黑粉菌,觀察其生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明:M-T型茭白黑粉菌只在半乳糖或蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基和pH等于5時(shí)出現(xiàn)形態(tài)變化,由 M-T型向 T型轉(zhuǎn)變;而 T型茭白黑粉菌在分別以蔗糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、果糖為唯一碳源,脲、酒石酸胺、蛋白胨、甘氨酸、硫酸胺、硝酸鉀、硝酸胺、谷氨酸鈉為唯一氮源,碳氮比分別為10:1、20:1、40:1、50:1的培養(yǎng)基及pH分別為3、5、6時(shí)出現(xiàn)形態(tài)變化,在體外培養(yǎng)的第8-10天

4、時(shí)由 T型向M-T型轉(zhuǎn)變。在不同溫度培養(yǎng)下,20℃環(huán)境下茭白黑粉菌生長(zhǎng)緩慢,28℃環(huán)境下茭白黑粉菌生長(zhǎng)較快,形態(tài)均未發(fā)生變化,37℃時(shí),兩種菌均不生長(zhǎng)。
　　(2)基于轉(zhuǎn)錄組及表達(dá)譜數(shù)據(jù),選取了在M-T型茭白黑粉菌和T型茭白黑粉菌中差異表達(dá)顯著的 UeICL基因(logFC=4.935)和UeMCP基因(logFC=1.986)進(jìn)行克隆和熒光定量 PCR。結(jié)果表明,UeICL基因全長(zhǎng)2059bp,UeMCP基因全長(zhǎng)1317bp,U

5、eICL基因和UeMCP基因在不同的碳源培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同時(shí)間的茭白黑粉菌中差異表達(dá)明顯,以 PD培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天的 T型茭白黑粉菌中UeICL基因和UeMCP基因的表達(dá)量作為對(duì)照,UeICL基因在麥芽糖培養(yǎng)基、蔗糖培養(yǎng)基、葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天的T型茭白黑粉菌中相對(duì)表達(dá)量分別為17.106,2.929,1.996;UeMCP基因在麥芽糖培養(yǎng)基、蔗糖培養(yǎng)基、葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天的T型茭白黑粉菌中相對(duì)表達(dá)量分別為3.107,2.154,0

6、.881,兩個(gè)基因均在麥芽糖培養(yǎng)基中的表達(dá)量最高。
　　(3)利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法構(gòu)建了茭白黑粉菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系。用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)T型茭白黑粉菌至OD600=0.8,使用7mg/mL的novozyme酶酶解40min制備原生質(zhì)體,所得到的原生質(zhì)體在含有0.6mol/L蔗糖的PDA再生培養(yǎng)基中進(jìn)行再生實(shí)驗(yàn),再生效果良好。在 STC-PEG的介導(dǎo)下,使用線性化的 pUMa207質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體,能獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子。
　　(

7、4)UeICL基因敲除菌株的構(gòu)建。在 pUMa1467載體的基礎(chǔ)上,利用golden gate cloning技術(shù)構(gòu)建了 UeICL基因的敲除轉(zhuǎn)化載體,經(jīng) PCR、測(cè)序和酶切驗(yàn)證載體構(gòu)建正確;采用建立的轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)化 T型茭白黑粉菌原生質(zhì)體后,通過連續(xù)4代繼代篩選,獲得了23個(gè)再生轉(zhuǎn)化子,PCR鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中3個(gè)轉(zhuǎn)化菌株同時(shí)具有UeICL特征序列和敲除菌株的上下游邊界序列,推測(cè)原始菌株存在多個(gè)拷貝的 UeICL。與野生型菌株相比,有1個(gè)