豬胸膜肺炎放線桿菌溶血毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ的提取純化及對小鼠致病性和免疫原性研究.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎是由豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)引起的一種傳染性呼吸道疾病。該病在各年齡階段豬均有發(fā)生。臨床癥狀以病豬呼吸困難為特征，病理變化主要是肺部不同程度的充血、出血和纖維素性肺炎，該病的發(fā)病率和死亡率常在20％以上，在我國的發(fā)生呈現(xiàn)上升趨勢，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。 APP的致病因子較多，包括莢膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白及溶血毒素(Ap

2、x)等，其中溶血毒素是最重要的致病因子，同時(shí)研究證實(shí)溶血毒素也是重要的免疫原性因子。本試驗(yàn)對毒素ApxI、ApxII、ApxⅢ進(jìn)行提純，并進(jìn)行三種毒素對小鼠致病性及免疫保護(hù)性的研究，為研制有效的多組分亞單位疫苗提供理論依據(jù)，對有效預(yù)防和控制豬傳染性胸膜肺炎，保護(hù)和促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。 本研究內(nèi)容分兩個(gè)部分： 第一部分：豬胸膜肺炎放線桿菌溶血毒素的提取與純化。 根據(jù)豬胸膜肺炎放線桿菌(APP)血清10

3、型只分泌ApxI、血清7型APP只分泌ApxII和血清3型主要分泌ApxⅢ的特點(diǎn)，分別對血清10、7、3型APP進(jìn)行培養(yǎng)，對毒素ApxI、ApxII、ApxⅢ進(jìn)行提取并對其純化。將血清10、7、3型APP山東分離株分別接種于含0.02％NAD的LB液體培養(yǎng)基中，并對毒素ApxI、ApxII、ApxⅢ最適分泌條件進(jìn)行優(yōu)化。在毒素ApxI、ApxII、ApxⅢ最適分泌條件下培養(yǎng)血清10、7、3型APP，將培養(yǎng)液4℃5000 r/min離心2

4、0 min，取上清液，經(jīng)硫酸銨鹽析、透析、濃縮、葡聚糖凝膠分子篩層析，分別從血清10、7、3型APP培養(yǎng)上清液中分離純化毒素ApxI、Apx II、ApxⅢ。純化的毒素ApxI、ApxII、ApxⅢ經(jīng)SDS-PAGE、Western blot進(jìn)行分析。結(jié)果毒素ApxI、ApxII、ApxⅢ最適分泌時(shí)間分別為12 h、12 h和24 h，最適硫酸銨飽和度均為60％。純化的毒素SDS-PAGE結(jié)果顯示，Apx I、Apx II、ApxⅢ大小

5、分別為105kD、103 kD、120 kD。在Western-blot中，三種毒素分別在相應(yīng)的分子量大小處出現(xiàn)特異性條帶，表明獲得的三種毒素具有良好的反應(yīng)原性。 第二部分：溶血毒素對小鼠致病性與免疫保護(hù)性的研究。 將純化的三種毒素分別進(jìn)行致病性與免疫原性研究。致病性試驗(yàn)中為驗(yàn)證毒素ApxI、ApxII、ApxⅢ的毒性，將純化的三種毒素進(jìn)行半數(shù)致死量測定，同時(shí)將試驗(yàn)分為對照、ApxI、ApxII和.ApxⅢ四組，試驗(yàn)組以

6、400μg/只的劑量腹腔注射小鼠，分別于1 d、7 d、14 d后眼眶放血致死，進(jìn)行血常規(guī)及血液生化相關(guān)指標(biāo)檢測，同時(shí)對體重變化進(jìn)行全程記錄。結(jié)果毒素ApxI、ApxII、ApxⅢ的半數(shù)致死量分別為80.9 mg/kg、108.6 mg/kg、128.8 mg/kg；毒素ApxI對小鼠的生長、血常規(guī)和血液生化指標(biāo)影響最大，其次為ApxII、ApxⅢ。免疫保護(hù)試驗(yàn)中，測定毒素ApxI、ApxII、ApxⅢ的最佳免疫劑量分別為40μg、50

7、μg、80μg。按最佳免疫劑量進(jìn)行不同組合，制備4種亞單位疫苗(ApxI+ApxII、ApxII+ApxⅢ、ApxI+ApxⅢ、ApxI+ApxII+ApxⅢ)，并分別于30日齡和40日齡免疫小鼠，60日齡時(shí)用血清1、3、5、7、10型APP攻毒。制備的4種亞單位疫苗免疫小鼠后，對血清1、3、5、7、10型APP攻擊的平均保護(hù)率分別為87.5％、80％、84.1％、97.5％，表明含三種溶血毒素的亞單位疫苗的免疫保護(hù)作用明顯優(yōu)于其它含有