豬胸膜肺炎放線桿菌OmpD、ApxⅣA蛋白表達(dá)及其免疫原性初步研究.pdf

1、豬胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）屬于巴氏桿菌科（Pasteurella），放線桿菌屬(Actinobacillus)?？梢l(fā)豬胸膜肺炎或胸膜炎，死亡率高，由于APP血清型多，交叉保護(hù)力差，目前沒(méi)有完全有效的疫苗。為研制高效疫苗，本試驗(yàn)表達(dá)了ApxⅣA和OmpD蛋白并初步研究了其免疫原性。
　　1.OmpD基因的擴(kuò)增及其生物信息學(xué)分析
　　根據(jù)GeneBank上3型A

2、PP全基因中的D15/omp基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，利用PCR方法擴(kuò)增獲得了1806 bp基因序列。通過(guò)DNAstar比對(duì)分析，核苷酸同源性為99.4％～99.8％，氨基酸同源性在98.7％～99.5％之間，同源性極高。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果表明其抗原性和穩(wěn)定性良好。
　　2.OmpD截短基因原核表達(dá)
　　在APP OmpD基因序列擴(kuò)增基礎(chǔ)上，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-ompD，并轉(zhuǎn)入Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)0.

3、4mmol/L IPTG誘導(dǎo)4.5 h，表達(dá)出大小約為87KD帶有His標(biāo)簽的包涵體蛋白。Western Blot試驗(yàn)顯示初步純化的蛋白反應(yīng)原性良好，為小鼠免疫試驗(yàn)提供抗原基礎(chǔ)。
　　3.ApxⅣA蛋白表達(dá)及間接ELISA優(yōu)化
　　以2.5μg/mL rApxⅣA包被酶標(biāo)板，5％明膠封閉2h;血清稀釋度為1∶50，作用60 min;酶標(biāo)二抗稀釋度為1∶3000，反應(yīng)1.5h條件最佳。陰陽(yáng)性血清臨界值為0.697。運(yùn)用建立的E

4、LISA方法和凝集試驗(yàn)分別對(duì)江西部分地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)不同階段的147份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，母豬和公豬APP抗體陽(yáng)性率分別為97.47％、98.73％，肥豬陽(yáng)性率皆為100％，保育豬陽(yáng)性率分別為18.75％、12.50％，小豬的陽(yáng)性率分別為26.19％、7.14％，兩者檢測(cè)結(jié)果基本一致，說(shuō)明建立的ELISA方法具有一定的可行性。
　　4.ApxⅣA和OmpD蛋白免疫原性初步研究
　　本試驗(yàn)分別表達(dá)了ApxⅣA和OmpD蛋白，與弗氏