斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)hepcidin抗菌肽的基因工程制備.pdf

1、我國為世界水產大國,也是世界上唯一水產養(yǎng)殖產量高于捕撈產量的國家。然而,亟待解決的種質、病害與環(huán)境等關鍵問題日趨嚴重。由于細菌性感染和細菌性疾病呈上升趨勢,為解決這些問題導致大量抗生素的使用,不僅破壞水產養(yǎng)殖動物體內的正常菌落,而且抗生素易在動物體內殘留?；蚬こ炭咕奶娲鷤鹘y抗生素或作為環(huán)保型餌料添加劑,既可以增強水產養(yǎng)殖生物的抗病能力,又可以提高養(yǎng)殖水產品的質量。
　　抗菌肽(Anti-bacterial peptides,簡

2、稱ABP)是在誘導的條件下,動物免疫防御系統產生的一類對抗外源性病原體致病作用的防御性肽類活性物質,是動物免疫防御系統的一個重要組成部分。抗菌肽具有廣譜抗菌活性,同時還具有高效的抗真菌、抗病毒和抗腫瘤活性。因此,抗菌肽類物質在醫(yī)藥和農業(yè)上有廣闊的應用前景。本研究涉及到的肝臟表達的抗菌肽hepcidin,最初是從人的血液中分離得到。目前已有的報道證明 hepcidin對革蘭氏陽性及陰性細菌均表現出抗菌活性,因此可以推測 hepcidin可

3、作為一種替代抗菌肽的綠色飼料添加劑在水產養(yǎng)殖中應用。本研究選取斑點叉尾鮰為研究對象,采用重組DNA技術來制備抗菌肽。
　　本研究內容主要分為五部分,第一部分主要是斑點叉尾鮰hepcidin原前體肽及成熟肽基因的cDNA克隆。從斑點叉尾鮰的肝臟中提取總RNA,根據已知的斑點叉尾鮰 hepcidin基因序列設計引物,以第一股cDNA為模板,利用RT-PCR技術擴增得到長度為291bp的hepcidin全長基因,再以hepcidin全長

4、基因為模板,利用巢式PCR技術分別擴增得到長度為219bp的hepcidin原前體肽基因和長度為78bp的hepcidin成熟肽基因,并進行了序列測定。Hepcidin全長基因編碼96個氨基酸殘基組成的多肽;經信號肽預測分析,該多肽的信號肽由24個氨基酸殘基組成,成熟肽由25個氨基酸殘基組成。斑點叉尾鮰與其他生物之間 hepcidin氨基酸序列的比對結果表明:斑點叉尾鮰與其他魚類hepcidin之間氨基酸序列有較高的同源性,與哺乳動物之

5、間顯示了低的同源性,但是無論是魚類還是哺乳動物都顯示出位于多肽羧基端的8個半胱氨酸殘基的高度保守,這與hepcidin抗菌活性密切相關。
　　第二部分主要是 hepcidin原前體肽基因和成熟肽基因的表達載體構建。以割膠純化后的原前體肽基因和成熟肽基因分別作為模板,設計含EcoR I和Hind III酶切位點的引物,分別擴增得到長度為236bp的原前體肽基因pCH和長度為95bp的成熟肽基因mCH,將pCH、mCH和表達載體pET

6、32a分別雙酶切,利用DNA重組技術,在T4DNA連接酶的作用下,將pCH和mCH分別與表達載體pET32a連接。經過菌落 PCR檢驗、雙酶切鑒定及序列測定證實:成功構建了 pET32a-pCH和pET32a-mCH重組表達質粒。
　　第三部分主要是pCH和mCH在大腸桿菌中的融合表達及表達產物的純化。將重組表達質粒pET32a-pCH和pET32a-mCH分別轉化宿主工程菌E.coli BL21(DE3),采用25℃,終濃度為1

7、mmol/L的IPTG誘導融合蛋白表達。Tricine-SDS-PAGE分析結果表明:融合蛋白TrxA-pCH和TrxA-mCH得到了大量的表達。為了進一步獲得高純度的融合蛋白,利用IMAC即Ni-IDA瓊脂糖凝膠柱的親和作用對超聲破碎后的總蛋白液進行層析,利用梯度的咪唑進行洗脫,通過Tricine-SDS-PAGE分析證明得到高純度的TrxA-pCH和TrxA-mCH融合蛋白,其對應的分子量分別為33kD和26kD,與推斷的分子量相符

8、。將得到的高濃度 TrxA-mCH融合蛋白進行腸激酶酶切處理。酶切后的酶切混合物再經過超濾離心分離濃縮經Tricine-SDS-PAGE分析后將含有目的蛋白mCH的凝膠進行MALDI-TOF-TOF分析,分析結果證明獲得了高純度的目的蛋白mCH。
　　第四部分主要是 mCH成熟肽的抑菌活性鑒定。抑菌活性鑒定采用瓊脂糖彌散法,以50μ g/mL氨芐青霉素為陽性對照,以無菌的ddH2O為空白對照。陽性對照產生了明顯的抑菌圈,而空白對照

9、未產生抑菌圈,說明抑菌實驗具有充分的可信度和較好的效果。mCH顯示出對革蘭氏陽性和陰性細菌的抑制作用。
　　第五部分主要是兩種hepcidin成熟肽基因的cDNA串聯及其真核表達載體的構建。根據已有的斑點叉尾鮰hepcidin成熟肽基因mCH及尼羅羅非魚hepcidin成熟肽基因mTH為模板,通過設計含有交叉互補序列的引物,利用SOE-PCR技術將mCH和mTH基因串聯擴增得到156bp的mCH-mTH片段。根據mCH-mTH的序