TRAIL與ADM聯(lián)合應(yīng)用抗人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：觀察腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7體外生長(zhǎng)增殖的影響、誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)及與阿霉素(ADM)聯(lián)用抗人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的效應(yīng)，判斷TRAIL與ADM同時(shí)或序貫聯(lián)用對(duì)MCF-7細(xì)胞是否具有協(xié)同作用，并初步探討其可能機(jī)制。 方法：人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7用含10％小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液于37℃，5％CO<,2>培養(yǎng)箱培養(yǎng)。測(cè)定細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)指標(biāo)后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，采用噻唑藍(lán)(M

2、TT)比色法測(cè)定細(xì)胞存活率；倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化：采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞TRAIL受體mRNA表達(dá)情況及TRAIL、ADM單用和聯(lián)用對(duì)MCF-7細(xì)胞死亡受體4(DR4)、死亡受體5(DR5)mRNA表達(dá)的影響；采用Western blot檢測(cè)TRAIL、ADM單用及聯(lián)用對(duì)MCF-7細(xì)胞Bax、Caspase-9蛋白表達(dá)的影響；采用Weeb系數(shù)法判斷TRAIL和ADM聯(lián)

3、用是否具有協(xié)同作用。 結(jié)果： (1)TRAIL濃度在0μg/ml～10μg/ml范圍內(nèi)，MCF-7細(xì)胞存活率與TRAIL濃度無(wú)明顯相關(guān)性(r=-0.313,P>0.05)，ICso>10μg/ml，提示人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7對(duì)TRAIL不敏感。 (2)ADM濃度在Oμg/ml～0.Mμg/ml范圍內(nèi)，MCF-7細(xì)胞存活率與ADM濃度呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.941，P<0.05)，IC<,50>為7.0μg/ml

4、，提示人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7對(duì)ADM敏感。 (3)采用Weeb系數(shù)法判定，0.5μg/ml ADM分別與0.1、1、10μg/ml TRAIL同時(shí)聯(lián)用時(shí)具有協(xié)同作用，以0.1μg/ml TRAIL與0.5μg/ml ADM聯(lián)時(shí)用協(xié)同效應(yīng)最強(qiáng)；0.05μg/ml ADM分別與0.1、0.01、1、10μg/mlTRAIL同時(shí)聯(lián)用及序貫聯(lián)用時(shí)雖無(wú)協(xié)同效應(yīng)，但與相應(yīng)濃度TRAIL單用比較，細(xì)胞存活率均顯著降低(P<0.05)，且相同

5、聯(lián)用濃度下同時(shí)聯(lián)用和序貫聯(lián)用兩種給藥方式對(duì)細(xì)胞存活率的影響無(wú)顯著性差異(P>0.05)；0.005μg/ml ADM與0.1、0.01、1、10μg/ml TRAIL同時(shí)聯(lián)用及序貫聯(lián)用后，與相應(yīng)濃度TRAIL單用比較，細(xì)胞存活率均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 (4)倒置相差顯微鏡觀察各組MCF-7細(xì)胞形態(tài)變化：與陰性對(duì)照組相比較，單用TRAIL組見部分細(xì)胞漂浮，漂浮細(xì)胞呈小圓形，胞壁不規(guī)整，細(xì)胞折光性減弱，其中可見少許細(xì)胞碎片

6、，殘存貼壁細(xì)胞部分變小變圓；單用ADM組基本無(wú)漂浮細(xì)胞，但貼壁細(xì)胞原有形態(tài)消失，細(xì)胞變圓腫脹，胞質(zhì)粗糙；同時(shí)聯(lián)用和序貫聯(lián)用組培養(yǎng)液中均見大量細(xì)胞漂浮，漂浮細(xì)胞形態(tài)與單用TRAIL組一致，其間可見部分細(xì)胞碎片，殘存的貼壁細(xì)胞形態(tài)與單用ADM組一致。 (5)FCM檢測(cè)顯示，0.1μg/ml TRAIL及0.5μg/ml ADM單用時(shí)，MCF-7細(xì)胞凋亡率分別為9.8％和17％，兩者同時(shí)聯(lián)用及序貫聯(lián)用后，細(xì)胞凋亡率分別增加至38.7％

7、和24.3％。結(jié)果提示：TRAIL與ADM聯(lián)用產(chǎn)生的協(xié)同作用可能是通過(guò)促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡引起的。 (6)RT-PCR結(jié)果顯示MCF-7細(xì)胞株有DR4、DR5、DcR2 mRNA的表達(dá)，而無(wú)DcR1 mRNA的表達(dá)；0.5μg/ml ADM單用及0.1μg/ml TRAIL與0.5μg/ml ADM同時(shí)聯(lián)用時(shí)，MCF-7細(xì)胞DR4、DR5 mRNA表達(dá)水平與陰性對(duì)照組和單用TRAIL組相比均明顯上調(diào)(P<0.05)。

8、(7)Western blot結(jié)果顯示，0.1μg/ml TRAIL與0.5μg/ml ADM同時(shí)聯(lián)用后，MCF-7細(xì)胞Bax及Caspase-9蛋白表達(dá)水平均明顯高于陰性對(duì)照組和單用TRAIL組水平(P<0.05)。 結(jié)論： (1)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7對(duì)TRAIL不敏感，對(duì)ADM敏感。 (2)0.5μg/ml ADM分別與0.1、1、10μg/ml TRAIL同時(shí)聯(lián)用具有協(xié)同作用，以0.1μg/ml TRA

9、IL與0.5Vg/ml ADM聯(lián)用時(shí)協(xié)同作用最強(qiáng)；序貫聯(lián)用雖無(wú)協(xié)同作用，但在一定濃度下，TRAIL與ADM序貫聯(lián)用亦能有效抑制人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞的增殖。 (3)TRAIL與ADM同時(shí)或序貫聯(lián)用較二者單用比，均可明顯促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡。 (4)MCF-7細(xì)胞株有DR4、DR5、DcR2 mRNA表達(dá)，而無(wú)DcR1 mRNA表達(dá)。DcR2 mRNA的高表達(dá)可能是造成MCF-7細(xì)胞對(duì)TRAIL不敏感的原因之一。