SiRNA介導(dǎo)的UBE2C沉默對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞株的影響.pdf

1、乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與，涉及復(fù)雜基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的過(guò)程。泛素-蛋白酶體途徑(Ubiquitin-Proteasome Pathway，UPP)異常與乳腺癌的這一過(guò)程密切相關(guān)。越來(lái)越多的證據(jù)表明UPP途徑通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白降解在乳腺癌的腫瘤形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。而作為泛素-蛋白酶體途徑重要組成部分的泛素偶聯(lián)酶2C(UBE2C)與乳腺癌的相關(guān)性越發(fā)受到關(guān)注。UBE2C的異常表達(dá)能通過(guò)使細(xì)胞提前終止有絲分裂、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)蛋白等多種方式

2、誘導(dǎo)乳腺癌進(jìn)展，因此，靶向UBE2C有望成為治療乳腺癌的新策略。然而，目前對(duì)于UBE2C基因?qū)θ橄侔┓肿诱{(diào)控的相關(guān)機(jī)制尚未明確。
　　目的:本研究以UBE2C基因?yàn)檠芯繉?duì)象，通過(guò)采用小干擾RNA(siRNA)介導(dǎo)的UBE2C基因觀察沉默UBE2C對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7增殖、凋亡及遷移活性的影響，此外，通過(guò)同時(shí)沉默UBE2C及P53基因，探討對(duì)以上生物學(xué)行為的分子機(jī)制，以期為UBE2C基因作為乳腺癌治療的靶點(diǎn)提供進(jìn)一步理論依據(jù)。

3、
　　方法:化學(xué)合成針對(duì)UBE2C基因的siRNA-UBE2C序列及siRNA-P53序列。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA至MCF-7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，采用Real-Time PCR及Westernblotting分別檢測(cè)UBE2C及P53mRNA水平和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，將未進(jìn)行任何處理的MCF-7細(xì)胞作為空白對(duì)照組，將轉(zhuǎn)染陰性序列的MCF-7細(xì)胞作為陰性對(duì)照組。采用siRNA-UBE2C轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，以雙轉(zhuǎn)染（siRNA-UB

4、E2C聯(lián)合siRNA-P53）細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對(duì)照，采用CCK8比色法對(duì)細(xì)胞的增殖進(jìn)行檢測(cè);通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞的凋亡進(jìn)行檢測(cè);通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移情況。
　　結(jié)果:1.Real-TimePCR檢測(cè)結(jié)果顯示:在進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的24h，沉默UBE2C組UBE2CmRNA水平與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比呈顯著下降，而相應(yīng)的P53 mRNA水平較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組呈上升趨勢(shì)。
　　2.Western blotting檢測(cè)結(jié)

5、果顯示:在進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的24h，沉默UBE2C組UBE2C蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組顯著降低，而P53蛋白水平表達(dá)較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組則呈上升趨勢(shì)。
　　3.Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示:在進(jìn)行轉(zhuǎn)染后24h，沉默P53組P53蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組下降;沉默P53組的UBE2C蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組變化不大。
　　4.CCK8法檢測(cè)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染UBE2C基因后6h，1

6、2h，24h，沉默UBE2C組細(xì)胞增殖率明顯高于空白對(duì)照組;雙轉(zhuǎn)染組（si-UBE2C+si-P53組）增殖率高于沉默UBE2C組，低于空白對(duì)照組。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染UBE2C基因后，沉默UBE2C組細(xì)胞凋亡率較空白對(duì)照組明顯升高;雙轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率低于沉默UBE2C組，高于空白組。
　　5.劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染UBE2C基因后，沉默UBE2C組細(xì)胞遷移能力低于空白對(duì)照組;雙轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移高于沉默UBE

7、2C組，低于空白對(duì)照組。
　　結(jié)論:1.沉默UBE2C基因可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的P53基因的表達(dá)，而沉默P53基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞MCF-7的UBE2C基因表達(dá)影響不大，提示UBE2C基因可能通過(guò)某種信號(hào)通路或某種基因直接或間接地調(diào)控P53基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。
　　2.沉默UBE2C基因能夠?qū)е氯橄侔㎝CF-7細(xì)胞系凋亡的增加，增殖及遷移能力降低，提示UBE2C基因在MCF-7細(xì)胞系的凋亡、增殖及遷移方面能夠通過(guò)某種機(jī)制發(fā)