低分子肝素對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的體外作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：通過研究低分子肝素(low molecular weighthegarin，LMWH)對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的體外作用，觀察低分子肝素對MCF-7細(xì)胞體外作用的影響，進(jìn)一步闡明低分子肝素抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡以及抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的可能機(jī)制，并探討其用于乳腺癌治療及化學(xué)預(yù)防的可行性。 方法： 1、體外培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(tetrzolium-based colorimetric as

2、say，MTT)比色法檢測低分子肝素對該細(xì)胞增殖的影響；應(yīng)用普通光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析低分子肝素對MCF-7細(xì)胞周期分布和凋亡的誘導(dǎo)作用；流式細(xì)胞儀測定低分子肝素處理細(xì)胞48h后p53、Bax的蛋白水平。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(revers transcriptionPCR，RT-PCR)半定量檢測低分子肝素處理細(xì)胞48h后p53、Bax mRNA的表達(dá)水平。 2、采用四甲基偶氮唑藍(lán)

3、比色法檢測低分子肝素對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7黏附的影響，采用Transwell小室法檢測低分子肝素對該細(xì)胞的遷移、侵襲的抑制作用，采用RT-PCR法半定量檢測低分子肝素處理細(xì)胞24h后TF mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果： 1、MTT比色法顯示低分子肝素(25、50、100IU/ml)對MCF-7細(xì)胞增殖具有抑制作用。不同濃度低分子肝素處理細(xì)胞48～72h后，與對照組相比，各處理組OD值均有不同程度下降，具有極顯著性差異(P

4、<0.01)。各處理組間比較，亦具有極顯著性差異(P<0.01)。且隨低分子肝素處理濃度的增大、作用時(shí)間的延長，OD值逐漸下降，即低分子肝素對MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用呈明顯的劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)依賴關(guān)系。25、50、100IU/ml低分子肝素作用MCF-7細(xì)胞48h后，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)果顯示：未經(jīng)藥物作用的細(xì)胞呈菱形或多形性，形態(tài)飽滿，低分子肝素作用MCF-7細(xì)胞48h后細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，破裂，變圓，有的細(xì)胞兩端出現(xiàn)細(xì)長的偽足，細(xì)

5、胞胞漿中出現(xiàn)空泡，脫落細(xì)胞增多。隨藥物濃度增大和作用時(shí)間延長，培養(yǎng)基中見到大量細(xì)胞碎片。在透射電鏡下觀察，正常MCF-7細(xì)胞形態(tài)較大，呈圓形，胞膜完整，表面有大量絨毛樣突起。細(xì)胞核大，形態(tài)不規(guī)則，有1～3個(gè)核仁，內(nèi)染色質(zhì)豐富，無明顯染色質(zhì)邊集。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富，可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、溶酶體等細(xì)胞器；100IU/ml低分子肝素作用48h后的MCF-7細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度凋亡性變：細(xì)胞體積縮小，微絨毛減少，胞質(zhì)濃縮，胞漿中出現(xiàn)較多空泡，胞核局部

6、向外呈銳角突起，核染色質(zhì)高度濃縮，電子密度增高，邊集于核膜下，形成沿核膜收縮的新月狀體。線粒體部分脊和膜融合消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有脫顆粒現(xiàn)象。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布顯示25、50、100IU/ml低分子肝素作用MCF-7細(xì)胞48h后，隨藥物濃度增大，G0/G1期細(xì)胞逐漸增多，S期細(xì)胞逐漸減少。即低分子肝素可阻滯MCF-7細(xì)胞周期進(jìn)程于G0/G1期，具有極顯著性差異(P<0.01)，該作用呈劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。 流式細(xì)胞儀可測得典

7、型的亞二倍體凋亡峰。凋亡百分率隨低分子肝素濃度增大和作用時(shí)間延長而逐漸升高。25、50、100IU/ml低分子肝素作用細(xì)胞48h后凋亡百分率分別為11.6％、23.5％、30.83％。流式細(xì)胞儀測定低分子肝素處理細(xì)胞48h后p53、Bax的蛋白水平；RT-PCR分析細(xì)胞p53、Bax mRNA表達(dá)水平；結(jié)果顯示：25、50、100IU/ml低分子肝素作用MCF-7細(xì)胞48h后，p53、Bax蛋白水平及tuRNA的表達(dá)水平隨處理濃度增大而

8、逐漸增強(qiáng)。差異均具有極顯著性(P<0.01)。 2、MTT比色法分析檢測低分子肝素對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞黏附的影響，結(jié)果顯示：不同濃度低分子肝素處理細(xì)胞60～120min后，與對照組相比，各處理組OD值均有不同程度下降，具有顯著性差異(P<0.05)。且隨低分子肝素處理濃度的增大OD值逐漸下降，即低分子肝素對MCF-7細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)成分Matrigel粘附力的抑制作用呈明顯的劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)顯示：MCF-7

9、細(xì)胞處理組(25、50、100IU/ml低分子肝素作用24h)較對照組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少，均有極顯著性差異(P<0.01)；其遷移抑制率和侵襲抑制率均隨低分子肝素濃度增大而顯著升高。低分子肝素對MCF-7細(xì)胞的遷移和侵襲抑制均具呈明顯的劑量--效應(yīng)依賴關(guān)系。半定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示：低分子肝素處理后MCF-7細(xì)胞TF mRNA表達(dá)水平與對照組相比明顯降低。 結(jié)論： 1、低分子肝素具有抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖及

10、誘導(dǎo)其凋亡的作用，為臨床乳腺癌的治療和化學(xué)預(yù)防提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 2 低分子肝素抑制結(jié)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖的作用呈時(shí)間-劑量依賴關(guān)系。 3、低分子肝素阻滯人乳腺癌細(xì)胞MCF-7于G0/G1期并可誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡。 4、低分子肝素可通過上調(diào)p53、Bax mRNA和蛋白表達(dá)水平而發(fā)揮其抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖、誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡的作用。 5、低分子肝素可通過下調(diào)TF mRNA表達(dá)水平抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7黏