低分子肝素對人乳腺癌細胞MCF-7的體外作用及其機制研究.pdf

1、目的：通過研究低分子肝素(low molecular weighthegarin，LMWH)對人乳腺癌細胞MCF-7的體外作用，觀察低分子肝素對MCF-7細胞體外作用的影響，進一步闡明低分子肝素抑制腫瘤細胞增殖、誘導凋亡以及抑制腫瘤細胞侵襲的可能機制，并探討其用于乳腺癌治療及化學預防的可行性。 方法： 1、體外培養(yǎng)人乳腺癌細胞MCF-7，采用四甲基偶氮唑藍(tetrzolium-based colorimetric as

2、say，MTT)比色法檢測低分子肝素對該細胞增殖的影響；應用普通光學顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察細胞的形態(tài)學變化；應用流式細胞儀分析低分子肝素對MCF-7細胞周期分布和凋亡的誘導作用；流式細胞儀測定低分子肝素處理細胞48h后p53、Bax的蛋白水平。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(revers transcriptionPCR，RT-PCR)半定量檢測低分子肝素處理細胞48h后p53、Bax mRNA的表達水平。 2、采用四甲基偶氮唑藍

3、比色法檢測低分子肝素對人乳腺癌細胞MCF-7黏附的影響，采用Transwell小室法檢測低分子肝素對該細胞的遷移、侵襲的抑制作用，采用RT-PCR法半定量檢測低分子肝素處理細胞24h后TF mRNA的表達水平。 結(jié)果： 1、MTT比色法顯示低分子肝素(25、50、100IU/ml)對MCF-7細胞增殖具有抑制作用。不同濃度低分子肝素處理細胞48～72h后，與對照組相比，各處理組OD值均有不同程度下降，具有極顯著性差異(P

4、<0.01)。各處理組間比較，亦具有極顯著性差異(P<0.01)。且隨低分子肝素處理濃度的增大、作用時間的延長，OD值逐漸下降，即低分子肝素對MCF-7細胞的增殖抑制作用呈明顯的劑量-效應和時間-效應依賴關(guān)系。25、50、100IU/ml低分子肝素作用MCF-7細胞48h后，光鏡下觀察細胞形態(tài)結(jié)果顯示：未經(jīng)藥物作用的細胞呈菱形或多形性，形態(tài)飽滿，低分子肝素作用MCF-7細胞48h后細胞出現(xiàn)皺縮，破裂，變圓，有的細胞兩端出現(xiàn)細長的偽足，細

5、胞胞漿中出現(xiàn)空泡，脫落細胞增多。隨藥物濃度增大和作用時間延長，培養(yǎng)基中見到大量細胞碎片。在透射電鏡下觀察，正常MCF-7細胞形態(tài)較大，呈圓形，胞膜完整，表面有大量絨毛樣突起。細胞核大，形態(tài)不規(guī)則，有1～3個核仁，內(nèi)染色質(zhì)豐富，無明顯染色質(zhì)邊集。細胞質(zhì)內(nèi)細胞器豐富，可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、溶酶體等細胞器；100IU/ml低分子肝素作用48h后的MCF-7細胞呈現(xiàn)不同程度凋亡性變：細胞體積縮小，微絨毛減少，胞質(zhì)濃縮，胞漿中出現(xiàn)較多空泡，胞核局部

6、向外呈銳角突起，核染色質(zhì)高度濃縮，電子密度增高，邊集于核膜下，形成沿核膜收縮的新月狀體。線粒體部分脊和膜融合消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有脫顆?，F(xiàn)象。流式細胞儀檢測細胞周期分布顯示25、50、100IU/ml低分子肝素作用MCF-7細胞48h后，隨藥物濃度增大，G0/G1期細胞逐漸增多，S期細胞逐漸減少。即低分子肝素可阻滯MCF-7細胞周期進程于G0/G1期，具有極顯著性差異(P<0.01)，該作用呈劑量-效應依賴關(guān)系。 流式細胞儀可測得典

7、型的亞二倍體凋亡峰。凋亡百分率隨低分子肝素濃度增大和作用時間延長而逐漸升高。25、50、100IU/ml低分子肝素作用細胞48h后凋亡百分率分別為11.6％、23.5％、30.83％。流式細胞儀測定低分子肝素處理細胞48h后p53、Bax的蛋白水平；RT-PCR分析細胞p53、Bax mRNA表達水平；結(jié)果顯示：25、50、100IU/ml低分子肝素作用MCF-7細胞48h后，p53、Bax蛋白水平及tuRNA的表達水平隨處理濃度增大而

8、逐漸增強。差異均具有極顯著性(P<0.01)。 2、MTT比色法分析檢測低分子肝素對人乳腺癌MCF-7細胞黏附的影響，結(jié)果顯示：不同濃度低分子肝素處理細胞60～120min后，與對照組相比，各處理組OD值均有不同程度下降，具有顯著性差異(P<0.05)。且隨低分子肝素處理濃度的增大OD值逐漸下降，即低分子肝素對MCF-7細胞與細胞外基質(zhì)成分Matrigel粘附力的抑制作用呈明顯的劑量-效應依賴關(guān)系。遷移和侵襲實驗顯示：MCF-7

9、細胞處理組(25、50、100IU/ml低分子肝素作用24h)較對照組穿膜細胞數(shù)顯著減少，均有極顯著性差異(P<0.01)；其遷移抑制率和侵襲抑制率均隨低分子肝素濃度增大而顯著升高。低分子肝素對MCF-7細胞的遷移和侵襲抑制均具呈明顯的劑量--效應依賴關(guān)系。半定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示：低分子肝素處理后MCF-7細胞TF mRNA表達水平與對照組相比明顯降低。 結(jié)論： 1、低分子肝素具有抑制人乳腺癌細胞MCF-7增殖及

10、誘導其凋亡的作用，為臨床乳腺癌的治療和化學預防提供了實驗依據(jù)。 2 低分子肝素抑制結(jié)人乳腺癌細胞MCF-7增殖的作用呈時間-劑量依賴關(guān)系。 3、低分子肝素阻滯人乳腺癌細胞MCF-7于G0/G1期并可誘導該細胞凋亡。 4、低分子肝素可通過上調(diào)p53、Bax mRNA和蛋白表達水平而發(fā)揮其抑制人乳腺癌細胞MCF-7增殖、誘導該細胞凋亡的作用。 5、低分子肝素可通過下調(diào)TF mRNA表達水平抑制人乳腺癌細胞MCF-7黏