Aurora-A通過(guò)異常調(diào)節(jié)DNA損傷應(yīng)答促進(jìn)腫瘤放化療抵抗.pdf

1、研究背景:
　　腫瘤細(xì)胞放化療抵抗?？蓪?dǎo)致腫瘤預(yù)后不良。Aurora-A激酶(Aurora-A)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，與有絲分裂的紡錘體分離，中心體復(fù)制相關(guān)，且在多種腫瘤中均高表達(dá)，是一種重要的癌基因。近期研究表明Aurora-A可促進(jìn)腫瘤放化療抵抗，由于Aurora-A與p53，BRCA1，BRCA2等多種DNA損傷應(yīng)答蛋白有著相互作用，因此我們推測(cè)Aurora-A很可能通過(guò)調(diào)節(jié)DNA損傷應(yīng)答促進(jìn)腫瘤放化療抵抗。
　　

2、研究目的:
　　研究Aurora-A與DNA損傷應(yīng)答的關(guān)系，揭示Aurora-A促進(jìn)腫瘤放化療抵抗的機(jī)理，探尋Aurora-A相關(guān)腫瘤的新型靶向藥物分子，以期達(dá)到腫瘤治療的最佳效果。
　　材料和方法:
　　第一部分.觀察Aurora-A對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
　　1).在乳腺癌、胰腺癌和卵巢癌細(xì)胞中選擇Aurora-A低表達(dá)的細(xì)胞系(MCF-7，PANC-1和OVCA420)，和Aurora-A高表達(dá)的細(xì)胞系(MDA

3、-MB-231，BXPC3和OVCA429)，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄病毒法轉(zhuǎn)入或沉默Aurora-A。
　　2).通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)和軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)分別繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和克隆形成率柱狀圖。
　　3)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期進(jìn)展。
　　第二部分.檢測(cè)Aurora-A對(duì)腫瘤放化療抵抗的影響。
　　1).用放射線，順鉑或者Aurora-A抑制劑VX680處理細(xì)胞后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。
　　2).用MTT檢測(cè)順鉑處

4、理后的細(xì)胞活力，并計(jì)算細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(IC50)。
　　第三部分.探究Aurora-A引起腫瘤放化療抵抗的機(jī)理
　　第一章.檢測(cè)Aurora-A與DNA損傷應(yīng)答的關(guān)聯(lián)
　　1).免疫熒光檢測(cè)Aurora-A與γ H2AX的關(guān)聯(lián)。
　　2).免疫印跡檢測(cè)Aurora-A對(duì)DNA損傷應(yīng)答蛋白(ATM， Chk2，ATR，Chk1，RAD51,H2AX,γ2AX,ERCC2,p53,pp53,AKT1,AKT2)的影

5、響。
　　第二章.檢測(cè)ATM抑制劑對(duì)腫瘤放化療抵抗和DNA損傷應(yīng)答的影響。
　　1).用ATM抑制劑KU-55933處理細(xì)胞，然后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。
　　2).用免疫印跡檢測(cè)ATM抑制劑對(duì)DNA損傷應(yīng)答蛋白(pp53，Chk2，γH2AX，RAD51等)的影響。
　　第三章.檢測(cè)BRCA1/2與Aurora-A之間的關(guān)系，并研究BRCA1/2對(duì)腫瘤放化療抵抗的影響以及與DNA損傷應(yīng)答之間的關(guān)聯(lián)。

6、>　　1).在乳腺癌，胰腺癌和卵巢癌細(xì)胞中選擇Aurora-A低表達(dá)的細(xì)胞系(MCF-7，PANC-1和OVCA420)，以及Aurora-A高表達(dá)的細(xì)胞系(MDA-MB-231，BXPC3和OVCA429)，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄病毒法或Fugene6轉(zhuǎn)染試劑使細(xì)胞沉默或者過(guò)量表達(dá)BRCA1/2。
　　2).用免疫印跡檢測(cè)BRCA1/2與Aurora-A之間的關(guān)聯(lián)。
　　3).通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)和軟瓊脂克隆試驗(yàn)分別繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和克隆形成

7、率柱狀圖。
　　4).用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期進(jìn)展。
　　5).細(xì)胞放化療處理后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。
　　6).免疫印跡檢測(cè)BRCA1/2對(duì)DNA損傷應(yīng)答蛋白(p53，pp53，ATM，Chk2，RAD51，γH2AX)的影響。
　　結(jié)果:
　　第一部分
　　Aurora-A可促進(jìn)細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期進(jìn)展和軟瓊脂克隆形成，而Aurora-A沉默可抑制細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期進(jìn)展和克隆形成。
　

8、　第二部分
　　放化療處理后，Aurora-A轉(zhuǎn)入的細(xì)胞系凋亡明顯降低，而Aurora-A沉默或者用Aurora-A抑制劑VX680處理的細(xì)胞系凋亡明顯增加;順鉑處理后，Aurora-A轉(zhuǎn)入的細(xì)胞系IC50增加，而Aurora-A沉默的細(xì)胞系IC50降低。
　　第三部分
　　第一章.Aurora-A降低了放射后γH2AX灶點(diǎn)形成，且Aurora-A可異常調(diào)節(jié)DNA損傷應(yīng)答。
　　第二章.ATM抑制劑可增加放化療引

9、起的腫瘤細(xì)胞凋亡，并且影響DNA損傷應(yīng)答蛋白表達(dá)。
　　第三章.BRCA1/2與Aurora-A負(fù)相關(guān)，且BRCA1/2可抑制細(xì)胞增殖，體外克隆形成和細(xì)胞周期進(jìn)展，并可通過(guò)影響DNA損傷應(yīng)答增加放化療引起的細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論:
　　研究發(fā)現(xiàn)，Aurora-A過(guò)表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期進(jìn)展，軟瓊脂克隆形成，并可直接或者間接通過(guò)上調(diào)ATM表達(dá)，下調(diào)BRCA1/2表達(dá)，調(diào)節(jié)DNA損傷應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤放化療抵抗;相反的