體外腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的放化療抵抗性研究.pdf

1、在全身惡性腫瘤中，惡性膠質(zhì)瘤的5年死亡率就僅次于胰腺癌和肺癌，5年生存率不足5％。腦膠質(zhì)瘤約占顱內(nèi)腫瘤的半數(shù)以上，腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病率為3-10/10萬(wàn)，占全身惡性腫瘤的1-3％。低級(jí)別膠質(zhì)瘤在病理上近于良性，侵襲性較小，即便如此，仍有將近一半的病人存活期不超過(guò)5年，腫瘤將從惡性程度較低的膠質(zhì)瘤發(fā)展到惡性程度較高的膠質(zhì)瘤，最后患者差不多都由于腫瘤復(fù)發(fā)和/或局部侵襲而死亡。
　　 目前手術(shù)切除是膠質(zhì)瘤是最基本、最直接的治療方法，治療作

2、用十分明確，其主要目的是降低致殘率和死亡率，最大程度的提高患者的生存質(zhì)量和生存時(shí)間。但由于膠質(zhì)瘤多呈侵潤(rùn)性生長(zhǎng)，手術(shù)過(guò)程中難以通過(guò)肉眼分辨其明確邊界，腫瘤常常難以徹底完全切除，因此在術(shù)后常常需要輔以放療、化療[1]。另有一部分患者因病變較小、位于功能區(qū)或因年齡較大、身體一般狀況差，拒絕或不宜行開(kāi)顱手術(shù)治療而單純選擇放療或化療作為治療手段。
　　 放射治療主要是利用放射線的穿透性和使生物細(xì)胞電離的特性，常用的射線有X線和γ線等，X

3、線和γ線等進(jìn)入組織后和活體組織中的原子相互作用，傳遞電離輻射能量。具有生物活性的組織吸收電離輻射能量后產(chǎn)生一系列異常復(fù)雜的物理、化學(xué)和生物學(xué)變化而導(dǎo)致組織的放射性損傷。放射治療包括普通放射治療、組織間的近距離照射和精確放射治療，精確放射治療又包括三維適形或調(diào)強(qiáng)放射治療以及立體定向放射治療（即X刀、γ刀）。無(wú)論采用哪種放射治療方法，它們均是通過(guò)使用x射線、γ射線等引起腫瘤組織、細(xì)胞的電離輻射效應(yīng)而達(dá)到治療目的[2]。
　　 膠質(zhì)瘤

4、的化學(xué)藥物治療和手術(shù)、放射治療一起構(gòu)成了膠質(zhì)瘤綜合治療體系，化學(xué)治療可以殺死手術(shù)后或者放療后的微小病灶，延緩膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā);或者使原本不能手術(shù)或不適宜手術(shù)的病人可以接受手術(shù)。但化學(xué)藥物治療也有比較大的副作用，全身用藥毒性較大，同時(shí)可能對(duì)患者的免疫系統(tǒng)造成抑制?；瘜W(xué)治療藥物分為兩大類，分別為細(xì)胞周期特異性藥物和細(xì)胞周期非特異性藥物。在選擇化療方案時(shí)常常考慮兩類藥物聯(lián)合使用。
　　 雖然目前膠質(zhì)瘤的綜合治療體系包括手術(shù)、放療和化療以及

5、目前正在進(jìn)行臨床研究的基因治療、免疫治療等，但是膠質(zhì)瘤的療效在10余年內(nèi)仍然沒(méi)有明顯進(jìn)展，最后患者幾乎由于腫瘤局部擴(kuò)散或局部侵襲或復(fù)發(fā)死亡。特別是惡性膠質(zhì)瘤的治療，即使手術(shù)加放化療的中位生存期也僅為14.6個(gè)月[4]。目前神經(jīng)外科學(xué)者普遍認(rèn)為，膠質(zhì)瘤治療的關(guān)鍵問(wèn)題在于現(xiàn)有治療不能有效抑制或延緩腫瘤復(fù)發(fā)。
　　 最近的研究認(rèn)為[6]，腫瘤是由一小群具有無(wú)限增殖及自我更新能力的干細(xì)胞樣細(xì)胞及由其產(chǎn)生的分化程度不均一的細(xì)胞團(tuán)組成，這群

6、干細(xì)胞樣細(xì)胞被稱為腫瘤干細(xì)胞(Tumor stem cell，TSC)，而腫瘤的主體卻是由失去了自我更新能力的具有一定分化特征的非干細(xì)胞樣細(xì)胞組成。腫瘤干細(xì)胞假說(shuō)最重要的特征是，腫瘤中僅腫瘤干細(xì)胞具有產(chǎn)生腫瘤及導(dǎo)致腫瘤治療后復(fù)發(fā)的能力。腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)[7]的提出對(duì)于認(rèn)識(shí)腫瘤的本質(zhì)，開(kāi)發(fā)新的腫瘤治療方法具有重要意義，傳統(tǒng)的治療方法，包括手術(shù)、放療和化療，是以整體腫瘤細(xì)胞作為治療靶的，并沒(méi)有專門(mén)針對(duì)于腫瘤干細(xì)胞。治療的結(jié)果就極有可能剩下具有

7、致瘤性并對(duì)治療具有更強(qiáng)抵抗性的腫瘤干細(xì)胞，從而導(dǎo)致腫瘤容易復(fù)發(fā)，難以根治。
　　 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞就是在此基礎(chǔ)上逐漸提出來(lái)的，最早被稱為神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞(neural stem-like cell)。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)的重要意義在于，如果我們能夠特異性的識(shí)別膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，并開(kāi)發(fā)出特異性針對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的靶向治療方法我們就才有可能徹底征服膠質(zhì)瘤。
　　 根據(jù)上述腫瘤干細(xì)胞和膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的學(xué)說(shuō)，認(rèn)為在腦腫瘤組織和體外培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)

8、胞系中存在有膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，并且由于膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對(duì)目前的治療方法具有一定的抵抗作用而導(dǎo)致膠質(zhì)瘤在治療后部分干細(xì)胞存活下來(lái)，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤在術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)。本課題就是在這樣的思路下進(jìn)行設(shè)計(jì)進(jìn)行的。
　　 首先在第一部分，我們將兩例新鮮惡性膠質(zhì)瘤組織細(xì)胞和U251細(xì)胞接種在含血清培養(yǎng)基中，待細(xì)胞生長(zhǎng)良好時(shí)，將細(xì)胞接種至無(wú)血清培養(yǎng)基中（DMEM/F12培養(yǎng)基，內(nèi)含B2720ul/ml，bFGF20ng/ml，EGF20ng/ml，LIF10n

9、g/ml）收集懸浮生長(zhǎng)的神經(jīng)球樣細(xì)胞，這些神經(jīng)球樣細(xì)胞經(jīng)過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)、傳代和擴(kuò)增后，再通過(guò)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的方法來(lái)檢測(cè)這些神經(jīng)球樣細(xì)胞是否表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133和ABCG2;再通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)在無(wú)血清培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)形成的球樣體細(xì)胞CD133和ABCG2的表達(dá);然后運(yùn)用免疫磁珠分選的方法，以CD133為標(biāo)志物，分選出CD133表達(dá)陽(yáng)性的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞;通過(guò)反復(fù)傳代培養(yǎng)的方式、單細(xì)胞克隆形成的方法和細(xì)胞移植裸鼠致瘤等方法來(lái)對(duì)其干細(xì)

10、胞特性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，在新鮮的膠質(zhì)瘤組組織細(xì)胞和U251細(xì)胞系中，通過(guò)在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，可以得到呈懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞球;經(jīng)過(guò)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞球細(xì)胞有明顯CD133和ABCG2的陽(yáng)性表達(dá);但經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD133和ABCG2的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，在懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞球里，U251細(xì)胞球中CD133+細(xì)胞僅為3.17％，而ABCG2+細(xì)胞僅為1.17％;而在人新鮮膠質(zhì)瘤組織細(xì)胞里，兩者的陽(yáng)性表達(dá)率分別為9.68％、1

11、1.25％和14.2％、17.8。經(jīng)過(guò)CD133標(biāo)記的免疫磁珠分選后CD133陽(yáng)性表達(dá)分別為88.2％、91.5％、87.4％。我們將分選后的CD133+細(xì)胞和CD133-細(xì)胞分別進(jìn)行了單細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)，結(jié)果顯示CD133+細(xì)胞克隆形成率達(dá)到78.5-92.4％，而CD133-細(xì)胞的僅有1.5％-4.7％。在裸鼠移植致瘤實(shí)驗(yàn)中，分別以CD133+細(xì)胞為102-103細(xì)胞/ml,CD133-細(xì)胞為1-5×105細(xì)胞/ml的密度以1ml接

12、種裸鼠腹部，CD133+細(xì)胞成瘤率達(dá)到80％(4/5)。通過(guò)第一部分的研究，我們發(fā)現(xiàn):在膠質(zhì)瘤組織和體外傳代培養(yǎng)的U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，的確有一小部分細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133和ABCG2;可在體外培養(yǎng)反復(fù)傳代，保持自我更新和無(wú)限增殖能力;經(jīng)過(guò)以CD133為標(biāo)記的免疫磁珠分選后可以分離純化膠質(zhì)瘤干細(xì)胞;CD33+細(xì)胞的單細(xì)胞克隆形成率以及裸鼠移植成瘤率都比CD133-細(xì)胞高。因此，我們可以認(rèn)為這一小部分表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)志物的細(xì)

13、胞群就是膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。
　　 在第二部分中，我們將分離鑒定得到的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，使用X線高能直線加速器對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行X線輻射處理，通過(guò)MTT比色法來(lái)檢測(cè)輻射后不同時(shí)間的細(xì)胞活性變化情況;在輻射處理72小時(shí)后流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD133和ABCG2表達(dá)并用Hochest3325染色檢測(cè)凋亡細(xì)胞核;使用Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒來(lái)檢測(cè)輻射處理后細(xì)胞的凋亡情況;通過(guò)以上的檢測(cè)結(jié)果來(lái)研究膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對(duì)放射治療的反應(yīng)情況;最后我

14、們將經(jīng)過(guò)6Gy輻射處理后72小時(shí)的細(xì)胞與未經(jīng)過(guò)X線輻射處理的細(xì)胞進(jìn)行配對(duì)處理，在替莫唑胺(TMZ)半數(shù)抑制濃度作用48小時(shí)后MTT比色法進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)、Annexin V-FITC試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，對(duì)目前膠質(zhì)瘤臨床治療放化療聯(lián)合方案對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的作用效果進(jìn)行研究。結(jié)果顯示:1在X線不同輻射劑量照射后，U251細(xì)胞以及U251腫瘤球細(xì)胞隨著輻射劑量的增加以及作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞的的活性顯著下降(P＜0.01);在相同劑量的不同作用時(shí)

15、間下細(xì)胞活性顯著性下降(P＜0.01)，但在3Gy輻射劑量時(shí)，在48hr與72h之間U251細(xì)胞的活性差異性不顯著(P=0.057);2在X線照射處理72h后，流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)CD133和ABCG2的表達(dá)，結(jié)果顯示，在3Gy、6G、9Gy的X線照射72h后，CD133的表達(dá)由3.17％上升到4.74％、8.35％、13.24％;ABCG2的表達(dá)上升到1.48％、3.51％、8.76％。3在72h后，hochest染色可見(jiàn)到各期細(xì)胞凋亡的細(xì)

16、胞核改變情況;4 AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒分別檢測(cè)了CD133+和CD133-細(xì)胞凋亡率以及人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251腫瘤細(xì)胞球和U251細(xì)胞凋亡率。其中CD133+細(xì)胞3Gy、6Gy、9Gy的劑量照射后72h的凋亡率分別為2.64±0.82％、4.53±1.19％、6.07±1.52％; CD33-細(xì)胞分別為9.73±0.92％、17.94±1.33％、25.19±1.56％;經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn):輻射處理后72小時(shí)CD1

17、33+細(xì)胞的凋亡率，在3Gy和6Gy放射劑量以及6Gy和9Gy放射劑量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有差異性(P＞0.05)，3Gy和9Gy的劑量下，凋亡率有顯著性差異(P＜0.01);CD133+細(xì)胞和CD133-陰性細(xì)胞、U251細(xì)胞以及U251細(xì)胞球細(xì)胞的凋亡率在同一X線劑量下有顯著性差異(P＜0.01); U251細(xì)胞球細(xì)胞和CD133-細(xì)胞和U251細(xì)胞凋亡率在同一X線劑量下有顯著性差異;U251細(xì)胞和D133-細(xì)胞之間在同一輻射劑量下凋亡率無(wú)

18、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。5將X線照射后CD133+細(xì)胞和CD133-細(xì)胞以及腫瘤球干細(xì)胞樣細(xì)胞與未經(jīng)照射處理的細(xì)胞配對(duì)處理后，接受替莫唑胺(TMZ)藥物作用。分別在藥物作用前和藥物作用后48hMTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性以及Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒檢查其凋亡率變化。結(jié)果顯示sphere、Sphere/IR、CD133+、CD133+/IR、CD133-、CD133-/IR各類細(xì)胞在藥物作用前MTT比色法檢測(cè)OD值為1

19、.241±0.11、0.785±0.055、1.257±0.08、1.147±0.084、1.241±0.103、0.568±0.046;在48h后為0.569±0.032、0.424±0.036、1.142±0.071、0.907±0.042、0.632±0.063、0.234±0.040。在藥物作用前的凋亡率分別是:0.53±0.12％、12.63±2.0％、0.40±0.09％、4.58±0.52％、0.60±0.4％、17.91

20、±2.0％;藥物作用48h后為18，75±2.7％、51.99±5.2％、2.62±0.7％、17.09±1.9％、21.98±3.4％、42.33±3.5％。經(jīng)配對(duì)T檢驗(yàn)和單因素方差分析表明在替莫唑胺(TMZ)作用前后，CD133+細(xì)胞在藥物作用前后的OD值變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;其余不同細(xì)胞組在藥物處理前后，其吸光度均有顯著性差異(P＜0.01);在替莫唑胺(TMZ)作用前后，其他細(xì)胞組，和CD133+細(xì)胞組比較，其MTT比色法檢測(cè)OD值

21、變化有顯著性差異(P＜0.01);但在輻射處理后的細(xì)胞之間，其OD值的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;藥物作用前后的凋亡率在不同細(xì)胞組之間，與CD133+細(xì)胞組比較，藥物處理前后細(xì)胞的凋亡率有顯著性差異(P＜0.01)。通過(guò)第二部分的研究，我們發(fā)現(xiàn):在X線不同輻射劑量照射后，細(xì)胞的活性隨著放射劑量的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，凋亡率隨著放射劑量的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加;隨著放射劑量的增加，懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞球中干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)增加;在輻射處理72小時(shí)后

22、，免疫磁珠分選的CD133+細(xì)胞的凋亡率在3、6Gy和6Gy、9Gy之間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異。這提示著表達(dá)CD133的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對(duì)X線輻射具有一定的抵抗性，因而在輻射處理后，其細(xì)胞凋亡率沒(méi)有隨著輻射劑量的增加而出現(xiàn)相應(yīng)的上升。我們將X線照射后CD133+細(xì)胞和CD133-以及腫瘤球干細(xì)胞樣細(xì)胞與未經(jīng)照射處理的細(xì)胞配對(duì)處理，分別檢測(cè)在TMZ作用前后的細(xì)胞活性以及凋亡率的變化，發(fā)現(xiàn)以CD133為標(biāo)志的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對(duì)TMZ具有抵抗性，與輻