鄰苯二甲酸二-(2-乙基己基)酯的雌性生殖毒性研究.pdf

1、鄰苯二甲酸二-(2-乙基己基)酯（DEHP）作為一種增塑劑被廣泛添加在各種塑料制品和化妝品中，含量最高可達30％。目前DEHP已經(jīng)形成了比較嚴重的環(huán)境污染，在全球幾乎所有的海洋、大氣、飲用水、植物及動物體內(nèi)都可不同程度地被檢出，它對人體的毒性作用越來越受到人們的關(guān)注。由于大量使用化妝品及洗漱用品，女性DEHP的暴露幾率遠高于男性，由于妊娠期對有害因素的影響更為敏感，因此有必要深入研究DEHP對女性生殖系統(tǒng)的不良影響。
　　流行病學

2、調(diào)查顯示流產(chǎn)、子癇前期及胎兒生長受限等不良妊娠結(jié)局與鄰苯二甲酸酯暴露密切相關(guān)。胎盤位于母胎界面，是胎兒對外來物質(zhì)發(fā)生反應的第一線，對妊娠的發(fā)生和維持有重要的作用。我們推測胎盤滋養(yǎng)細胞可能是鄰苯二甲酸酯重要的靶細胞，從DEHP作用后滋養(yǎng)細胞相關(guān)生物學功能的改變?nèi)胧?，就有可能抓住DEHP影響生殖健康的主要環(huán)節(jié)。本課題擬通過以下四部分實驗，探討DEHP對體外培養(yǎng)滋養(yǎng)細胞的作用及機制，并通過動物實驗，探討DEHP的雌性生殖毒性。
　　實驗

3、一早孕絨毛外滋養(yǎng)細胞的分離、鑒定和培養(yǎng)
　　【目的】建立分離正常早孕絨毛組織獲得高純度的絨毛外滋養(yǎng)細胞（EVTs）的方法，并對其進行鑒定和培養(yǎng)。
　　【方法】無菌條件下獲取人工流產(chǎn)早孕絨毛組織，經(jīng)機械剪碎后通過溫和的酶消化方法獲得滋養(yǎng)細胞，經(jīng)1.25-2.5％BSA密度梯度沉降法純化EVTs。將分離純化后EVTs接種在Matrigel包被的細胞板上培養(yǎng)。用免疫細胞化學方法，進行CK-7、HLA-G和波形蛋白檢測，熒光顯微鏡下

4、觀察鑒定EVTs。
　　【結(jié)果】經(jīng)分離純化后的EVTs體積較大，呈不規(guī)則多邊形，核大，胞漿豐富。細胞呈單片狀聚集生長，但彼此并不融合。EVTs在Matrigel包被的細胞板上生長狀態(tài)良好，接種于未包被Matrigel的細胞板上的細胞大多數(shù)在24h內(nèi)死亡。CK-7、HLA-G在EVTs胞漿和胞膜上陽性表達，EVTs內(nèi)無波形蛋白表達。成纖維細胞胞漿內(nèi)可見波形蛋白表達，但CK-7和HLA-G不表達。分離的細胞中EVTs數(shù)量超過95％。<

5、br>　　【結(jié)論】用溫和的酶消化法和BSA密度梯度沉降法可獲得的高純度EVTs。Matrigel是EVTs體外培養(yǎng)過程必要條件。EVTs在包被Matrigel的細胞板上生長狀態(tài)良好，特征性蛋白CK-7和HLA-G表達陽性。
　　實驗二DEHP對絨毛外滋養(yǎng)細胞浸潤能力的影響及其機制
　　【目的】探討DEHP對原代培養(yǎng)人早孕絨毛外滋養(yǎng)細胞浸潤能力的影響及其機制。
　　【方法】以25、50、100μmol/LDEHP處理DE

6、HP24h后，通過體外侵襲實驗檢測DEHP干預后EVTs浸潤能力的改變，通過RT-PCT和WesternBlot方法檢測細胞內(nèi)侵襲相關(guān)基因MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白表達的改變。
　　【結(jié)果】DEHP干預后通過體外侵襲實驗檢測，EVTs的浸潤能力具有不同程度下降。劑量為50和100μmol/L時DEHP組與對照組侵襲指數(shù)差別顯著（P<0.05）。DEHP作用后50μM和100μM劑量組MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋

7、白表達量較對照組明顯降低（P<0.05），而且隨著DEHP劑量增加MMP-2和MMP-9mRNA和蛋白表達量逐漸降低，呈劑量效應負相關(guān)。
　　【結(jié)論】劑量大于50μmol/L時，DEHP可降低早孕絨毛外滋養(yǎng)細胞浸潤能力，其機制可能與抑制MMP-2和MMP-9表達相關(guān)。
　　實驗三DEHP對絨毛外滋養(yǎng)細胞凋亡的影響及其機制
　　【目的】探討DEHP對原代培養(yǎng)人早孕絨毛外滋養(yǎng)細胞凋亡的影響及其機制。
　　【方法】以2

8、5、50、100μmol/LDEHP處理DEHP24h后，通過原位缺口末端標記法檢測DEHP干預后EVTs細胞凋亡數(shù)的改變，通過RT-PCR和WesternBlot方法檢測細胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax的mRNA和蛋白表達的改變。
　　【結(jié)果】DEHP干預后經(jīng)原位缺口末端標記法檢測，不同劑量DEHP干預組EVTs細胞凋亡數(shù)均有不同程度的增加，劑量為50和100μmol/L時DEHP組與對照組凋亡數(shù)差別顯著（P<0.05）。D

9、EHP作用后50μM和100μM劑量組Bax的mRNA和蛋白表達量較對照組明顯增加，而且隨著DEHP劑量增加BaxmRNA和蛋白表達量逐漸增加。DEHP各組Bcl-2的mRNA和蛋白表達量與對照組相比沒有明顯差異（P>0.05）。隨著DEHP劑量增加Bcl-2和Bax蛋白表達量的比值逐漸降低，呈劑量效應負相關(guān)。
　　【結(jié)論】劑量大于50μmol/L時，DEHP可誘導EVTs細胞凋亡增加，其機制可能與誘導促凋亡基因Bax的表達相關(guān)，

10、DEHP對Bcl-2的表達沒有明顯影響。
　　實驗四DEHP對雌性大鼠早期妊娠及胚胎發(fā)育的影響
　　【目的】探討DEHP在體內(nèi)對雌性大鼠早期妊娠及胚胎發(fā)育的影響。
　　【方法】40只大鼠分為4組，DEHP5、25、50mg/kg分別為低、中、
　　高劑量組，對照組為玉米油。妊娠早期（1-6d）灌胃給予不同劑量DEHP，妊娠14d處死孕鼠剖腹檢測DEHP對胚胎著床情況的影響。另外40只大鼠分組方法同上，在妊娠中晚期

11、（7-20d）給予不同劑量DEHP，妊娠末期處死，剖腹檢測胚胎畸形和胎盤發(fā)育情況。
　　【結(jié)果】DEHP妊娠早期干預各組和妊娠中晚期干預各組大鼠體重與對照組沒有顯著差異（P>0.05）。中劑量和高劑量DEHP干預后，胚胎著床數(shù)降低，胚胎數(shù)和活胎數(shù)減少，胚胎和胎盤重量均低于對照組（P<0.05）。
　　【結(jié)論】DEHP對母鼠沒有明顯影響時，在中高劑量組DEHP但仍可在妊娠早期影響胚胎著床過程，造成胚胎丟失。DEHP還可在妊娠中

12、晚期影響胚胎及胎盤發(fā)育，導致胎兒活胎數(shù)降低，胎兒發(fā)育不良、胎兒畸形數(shù)增加。
　　綜上所述，本課題首先以完善可靠的人早孕絨毛外滋養(yǎng)細胞原代分離純化方法為基礎，以絨毛外滋養(yǎng)細胞為體外研究模型，檢測了DEHP對絨毛外滋養(yǎng)細胞浸潤的能力及細胞凋亡的影響，并初步探討其作用機制；最后，以妊娠大鼠為體內(nèi)研究模型，探討了DEHP對早期妊娠著床及胚胎發(fā)育的影響。本課題在體內(nèi)外實驗中證實了DEHP對滋養(yǎng)細胞生物學行為有不良影響，并從基因水平闡明了其作