鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）致附睪生殖毒性及鋅保護(hù)作用研究.pdf

1、研究背景：隨著現(xiàn)代工業(yè)發(fā)展，環(huán)境污染對人類和動物的危害已成為國際性研究熱點(diǎn)。前期研究提示，某些廣泛存在于環(huán)境中的外來化合物(主要是人工合成化合物)可通過各種途徑富集于人和動物體內(nèi)，干擾內(nèi)源性激素的合成、分泌、釋放、運(yùn)輸、結(jié)合、效應(yīng)及清除等各個環(huán)節(jié)，顯出模擬或拮抗內(nèi)源性激素的作用，從而導(dǎo)致生殖功能下降、生殖系統(tǒng)畸形和惡性腫瘤等的發(fā)病率增加。該類化合物被稱為環(huán)境內(nèi)分泌干擾因子(Environmental endocrine disrupto

2、rs，EEDs)。在眾多的EEDs中，鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯[Di(2-ethylhexyl)phthalate，DEHP]，作為一種廣泛應(yīng)用于塑料及化工產(chǎn)業(yè)的增塑劑，近年來已被認(rèn)為是一種重要的EEDs。 流行病學(xué)調(diào)查顯示全球范圍男性精液質(zhì)量呈下降趨勢，已有研究表明這種現(xiàn)象與EEDs的抗雄激素作用有關(guān)。附睪作為精子成熟和獲能的重要場所，附睪上皮細(xì)胞在此過程中發(fā)揮著重要作用。我們推測EEDs損害附睪上皮細(xì)胞可能是導(dǎo)致精液質(zhì)量

3、下降、附睪功能障礙的重要環(huán)節(jié)，為此我們擬通過動物實驗探討 DEHP 對附睪的病理及功能損害的機(jī)制，并探尋保護(hù)因子，對針對性治理環(huán)境污染、預(yù)防和改善男性生殖功能障礙、促進(jìn)人類健康具有重要的意義。 目的：探討DEHP 對附睪的生殖毒性和生殖內(nèi)分泌干擾的機(jī)理，探尋DEHP 毒性作用的拮抗劑。 方法：實驗分為體內(nèi)和體外實驗兩部分，實驗對象為雄性昆明小鼠。(1)體內(nèi)實驗：實驗動物選擇性未成熟期(PND20)的雄性小鼠和性成熟期(P

4、ND50)雄性小鼠，每期動物隨機(jī)分為四組：正常對照組、玉米油組、DEHP 組和DEHP+葡萄糖酸鋅組。各組動物經(jīng)灌胃建立染毒模型，每天連續(xù)灌胃10天后處死動物，進(jìn)行以下檢測：附睪重量測量，附睪組織光鏡和電鏡觀察，平均附睪管直徑和附睪上皮高度測量，免疫組織化學(xué)法(SABC)檢測附睪組織中AR及ER表達(dá)水平。(2)體外實驗：選取PND20和PND50小鼠附睪分別進(jìn)行附睪上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)，在培養(yǎng)第三天，將不同時期小鼠附睪上皮細(xì)胞分別隨機(jī)分為四

5、組：正常對照組、睪酮對照組、DEHP組和DEHP+葡萄糖酸鋅組，第10天終止培養(yǎng)，進(jìn)行以下檢測：附睪上皮細(xì)胞增殖生長情況；MTT法測定細(xì)胞活力；附睪的功能性指標(biāo)SA含量、α-1、4-糖苷酶及LDH活性。 結(jié)果： 體內(nèi)實驗： 性未成熟期(PND20)雄性小鼠： (1)DEHP組附睪重量較正常對照組、玉米油組、DEHP+葡萄糖酸鋅組減輕(p<0.01)；(2)DEHP 組較正常對照組、玉米油組、DEHP+葡萄

6、糖酸鋅組平均附睪管腔直徑縮小，附睪上皮高度降低(p<0.01)；(3)光鏡觀察可見DEHP組附睪上皮細(xì)胞空泡變性、脫落、上皮細(xì)胞纖毛排列紊亂甚至斷裂、附睪間質(zhì)組織增生、附睪管腔中精子數(shù)量減少，正常對照組、玉米油組和 DEHP+葡萄糖酸鋅組附睪組織未見明確病理改變；(4)透射電鏡觀察可見DEHP 組附睪上皮細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池擴(kuò)張、溶酶體數(shù)目增多、管周平滑肌細(xì)胞肌纖維減少而線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生，DEHP+葡萄糖酸鋅組僅見附睪上皮細(xì)

7、胞內(nèi)線粒體腫脹，正常對照組和玉米油組附睪組織未見明顯異常；(5)DEHP 組較正常對照組、玉米油組、DEHP +葡萄糖酸鋅組 AR 表達(dá)水平下降(p<0.01)；(6)DEHP 組較正常對照組、玉米油組、DEHP+葡萄糖酸鋅組ER表達(dá)水平升高(p<0.01)；(7)正常對照組、玉米油對照組和DEHP+葡萄糖酸鋅組間比較，各種實驗結(jié)果無顯著差異。 性成熟期(PND50)雄性小鼠： (1)各組附睪重量比較無顯著性差異(p>0

8、.05)；(2)各組平均附睪管腔直徑、附睪上皮高度比較無顯著性差異(p>0.05)；(3)光鏡觀察各組附睪組織未見明確病理改變；(4)透射電鏡觀察各組附睪組織未見明確異常；(5)DEHP組較正常對照組AR表達(dá)水平下降(p<0.01)；(6)DEHP組較正常對照組ER表達(dá)水平升高(p<0.01)；(7)正常對照組、玉米油對照組和 DEHP+葡萄糖酸鋅組間比較，各種實驗結(jié)果無顯著差異。 體外實驗： 性未成熟期(PND20)雄

9、性小鼠： (1)MTT試驗提示DEHP組細(xì)胞活性與正常對照組、睪酮組、DEHP+葡萄糖酸鋅組比較降低(p<0.01)； (2)DEHP組較正常對照組、睪酮組、DEHP+葡萄糖酸鋅組SA含量升高(p<0.01)； (3)DEHP組較正常對照組(p<0.05)、睪酮組(p<0.01)附睪上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)上清液中α-1、4-糖苷酶活性降低；(4)DEHP 組較正常對照組LDH活性下降(p<0.01)；(5)正常對照組、睪酮組和 DEH

10、P+葡萄糖酸鋅組間比較，各種實驗結(jié)果無顯著差異。 性成熟期(PND50)雄性小鼠： (1)MTT試驗提示DEHP 組細(xì)胞活性與正常對照組、睪酮組比較降低(p<0.01)； (2)DEHP 組較睪酮組SA含量升高(p<0.01)； (3)各組附睪上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)液上清中α-1、4-糖苷酶活性比較無顯著性差異(p>0.05)；(4)各組LDH活力比較無顯著性差異(p>0.05)；(5)正常對照組、睪酮對照組和DEHP+葡萄糖