2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、馬鈴薯是世界第四大糧食作物,用途廣泛,其加工產(chǎn)品炸片和炸條是重要的油炸食品。為了抑制常溫貯藏產(chǎn)生的塊莖失水皺縮、病害傳播、發(fā)芽等現(xiàn)象及延長加工周期,通常將馬鈴薯塊莖貯藏在低溫條件下。但低溫常使塊莖中的淀粉加速轉(zhuǎn)化為還原糖,高溫油炸加工時,還原糖與塊莖中游離的氨基酸發(fā)生褐化反應(yīng),嚴(yán)重影響油炸產(chǎn)品的色澤和品質(zhì),甚至對人體健康產(chǎn)生不良影響。因此,控制“低溫糖化”已經(jīng)成為馬鈴薯采后生理學(xué)研究的熱點。塊莖“低溫糖化”是個復(fù)雜的數(shù)量性狀,涉及淀粉.

2、糖代謝的多種路徑,調(diào)節(jié)和反饋因子多,因此“低溫糖化”的機理研究是馬鈴薯加工品質(zhì)改良的重要基礎(chǔ)工作。在植物體內(nèi),蔗糖降解只有兩個途徑:蔗糖合成酶途徑和轉(zhuǎn)化酶途徑。轉(zhuǎn)化酶,又稱蔗糖轉(zhuǎn)化酶,可分為中性(或堿性)轉(zhuǎn)化酶和酸性轉(zhuǎn)化酶,其中,酸性轉(zhuǎn)化酶又包括液泡轉(zhuǎn)化酶和胞壁轉(zhuǎn)化酶。前人的研究表明,酸性轉(zhuǎn)化酶活性與還原糖/蔗糖比率成顯著正相關(guān),從而成為淀粉一糖代謝中的關(guān)鍵酶之一。因此,進一步明確轉(zhuǎn)化酶在調(diào)控馬鈴薯低溫糖化過程中的作用,對于馬鈴薯淀粉一

3、糖代謝的調(diào)控進而提高馬鈴薯低溫貯藏下的加工品質(zhì)具有重要的理論和實踐意義。 本研究旨在克隆馬鈴薯內(nèi)源酸性轉(zhuǎn)化酶基因,并通過構(gòu)建組成型啟動子CaMV35S和塊莖特異表達啟動子CIPP驅(qū)動的反義基因(或片段)載體以及RNA干涉載體轉(zhuǎn)化馬鈴薯,對內(nèi)源酸性轉(zhuǎn)化酶基因的表達進行調(diào)控,進一步明確其在淀粉一糖代謝過程中的作用,揭示酸性轉(zhuǎn)化酶在調(diào)控馬鈴薯低溫糖化中的關(guān)系。主要結(jié)果如下: 1.以發(fā)表的酸性轉(zhuǎn)化酶基因的序列設(shè)計引物,采用RT-

4、PCR的方法,從低溫處理的馬鈴薯品系JH塊莖eDNA中克隆到全長為1920bp的特異條帶,DNA序列測定結(jié)果顯示,目標(biāo)片段為inv的完整的編碼序列,為一個開放讀碼框,編碼639個氨基酸。Blasm結(jié)果顯示,該片段與已知的酸性inv基因cDNAS70040(番茄)以及液泡轉(zhuǎn)化酶cDNA X70368.1(馬鈴薯)、Z12025(番茄)和Z12026(醋栗番茄)的同源性分別達到95%,98%,96%和96%。其中,Expasy蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測的

5、結(jié)果顯示,氨基酸序列的34到56有一個跨膜結(jié)構(gòu)域KIISGIFLSSFLLSVAFFPILN,同時,在N端1-49存在一個信號結(jié)構(gòu),在614的位置存在一個蛋白剪切位點GAS,120-124和299-303為inv基因的兩個保守位點NDPNG和WECVD,在靠近N端的序列中還存在幾處糖基化位點。上述結(jié)果初步證明,所克隆的cDNA為馬鈴薯液泡轉(zhuǎn)化酶基因,該序列已經(jīng)在GenBank注冊,登記號為AY341425。 2.通過PCR.擴增

6、和限制酶切,將克隆的cDNA分為靠近5’端(397bp),包含有保守位點的中間區(qū)段(625bp)以及靠近3’端(955bp)的三個片段。四個片段(包括全長)分別與35S和CIPP啟動子構(gòu)建成反義載體轉(zhuǎn)化馬鈴薯。對轉(zhuǎn)基因塊莖進行低溫貯藏(設(shè)置常溫貯藏對照)后測定酸性轉(zhuǎn)化酶活性和還原糖含量,結(jié)果顯示,不同插入片段大小對酶活性和還原糖含量的影響沒有顯著差異。其中,35S啟動子的轉(zhuǎn)基因株系中,低溫(4℃)貯藏下,酸性轉(zhuǎn)化酶活性2005年的平均下

7、降幅度從為29%-47%,2006年平均降幅為10%-13%;還原糖含量2005年的平均降幅為19%-26%,2006年為29%-34%。室溫(20℃)貯藏下,2005年的酸性Inv活性降幅均在60%以上,但還原糖含量變化不大;而2006年的還原糖含量下降均達到30%以上,酸性Inv活性無顯著變化。兩類啟動子轉(zhuǎn)基因株系的抑制效率存在顯著差異。4℃貯藏條件下,CIPP啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)基因植株的酶活性下降53%(貯藏6周)和21%(貯藏10周

8、),還原糖含量下降35%(貯藏6周)和67%(貯藏10周);但是室溫貯藏條件下,不同啟動子的轉(zhuǎn)基因株系的平均酶活和還原糖含量都沒有明顯差異。試驗結(jié)果證明,所使用的cDNA片段均能達到相似的反義抑制效果。而采用塊莖特異表達的CIPP啟動子的轉(zhuǎn)化植株,其塊莖的酸性轉(zhuǎn)化酶活性和還原糖含量在低溫貯藏下的抑制效果均優(yōu)于組成型表達的35S啟動子。 3.研究還構(gòu)建了RNA干涉載體并轉(zhuǎn)化馬鈴薯,并對轉(zhuǎn)基因植株和試管薯進行酸性轉(zhuǎn)化酶活性的測定。結(jié)

9、果表明,在測定的5個株系中,植株的酸性轉(zhuǎn)化酶活性均有不同程度的下降,其中除Ni-1外,酶活下降均在65%以上,最大降幅為78%(Ni-4),平均下降59.3%。而同時測定的抑制效果較好的反義轉(zhuǎn)基因株系中,酸性轉(zhuǎn)化酶活性最大降幅為84%(ES4-3),平均下降58.4%,表明RNAi技術(shù)在馬鈴薯抗“低溫糖化”基因工程中也同樣具有較好的應(yīng)用潛力。 4.Northern分析表明,轉(zhuǎn)基因植株和塊莖中反義RNA的表達量在不同的啟動子之間存

10、在一定的差異,其中,35S啟動子所驅(qū)動的株系在植株和塊莖中均有強烈的表達,CIPP啟動子所驅(qū)動的株系只在塊莖中呈現(xiàn)強烈的表達,而在植株的表達幾乎沒有,也再次證實了CIPP啟動子的塊莖特異性。RNA干涉的轉(zhuǎn)基因植株中內(nèi)源酸性轉(zhuǎn)化酶的mRNA表達量也明顯降低。Northern分析進一步說明酸性轉(zhuǎn)化酶的反義抑制和RNA干涉顯著降低了植株內(nèi)源酸性轉(zhuǎn)化酶的mRNA的表達,證明Invertase可能主要在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控塊莖低溫糖化。 5.

11、對抑制效果較好的株系進行塊莖低溫貯藏以后,測定了其蔗糖和淀粉含量。結(jié)果表明,在低溫貯藏(4℃)條件下,株系ES4-3的抑制效率達到最高,酸性轉(zhuǎn)化酶活性降低了72%,還原糖含量下降了68.7%,同時引起蔗糖含量的上升(含量增加92.4%)和淀粉的積累(淀粉含量增加7.2%)。同時,EC4-5和EC19-5的酸性轉(zhuǎn)化酶活性也分別表現(xiàn)出33.4%和23.9%的下降,還原糖含量分別下降8.69%和69.5%,從而導(dǎo)致蔗糖含量分別增加了7.6%和

12、12.2%??傮w上,轉(zhuǎn)基因株系中酸性轉(zhuǎn)化酶活性和還原糖含量的大量變化能夠引起蔗糖分解顯著降低,但對淀粉的合成并沒有明顯的促進。在室溫貯藏(20℃)條件下,除個別株系(EC4-5)外,各測定指標(biāo)變化不大。證明低溫導(dǎo)致的塊莖還原糖積累可能主要來自于蔗糖分解途徑,而不是淀粉降解。 6.選取測定結(jié)果較好的轉(zhuǎn)基因塊莖及其非轉(zhuǎn)基因?qū)φ蘸图庸て贩N對照,低溫貯藏后進行炸片試驗。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因塊莖的炸片色澤指數(shù)較非轉(zhuǎn)基因?qū)φ站兴档?,同一株?/p>

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