IL-21對銀屑病Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的研究.pdf

1、銀屑病是一種嚴(yán)重危害人類健康的自身免疫性疾病，是在多基因遺傳背景下由T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性、復(fù)發(fā)性疾病，病人機體免疫系統(tǒng)紊亂，造成臨床上典型的皮膚鱗屑性炎癥病變。但到目前為止，對其發(fā)生的免疫學(xué)機制尚不完全清楚，因此，進(jìn)一步探索研究新的T細(xì)胞亞群與銀屑病發(fā)生的關(guān)系，以及細(xì)胞因子對T細(xì)胞亞群的調(diào)節(jié)作用，對深入揭示銀屑病發(fā)病的免疫學(xué)機制、尋找新的治療靶標(biāo)和藥物、防治銀屑病都具有重大的意義。
　　 免疫自穩(wěn)對防止自身免疫性疾病的發(fā)生和維持體內(nèi)

2、免疫平衡發(fā)揮了重要的作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells，Treg細(xì)胞)具有免疫抑制作用，在外周免疫耐受中起關(guān)鍵作用。Th17細(xì)胞是最近新發(fā)現(xiàn)的一群產(chǎn)生IL-17的輔助型T細(xì)胞，而IL-17是一種強大的前炎癥性細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)炎癥發(fā)生和組織損傷，加重自身免疫性疾病的發(fā)生。Treg細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞之間的相互作用對于維持有效的免疫反應(yīng)和病理損傷的平衡至關(guān)重要。同時在T淋巴細(xì)胞亞群的分化和作用中，各種細(xì)胞因子發(fā)揮著不可替代的

3、作用。IL-21R在組織細(xì)胞上的廣泛表達(dá)引起了學(xué)者對IL-21的關(guān)注，研究提示，IL-21通過一些重要的免疫細(xì)胞發(fā)揮作用，IL-21能夠調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞活化和增殖，抑制Treg細(xì)胞的分化及抵抗Treg細(xì)胞對效應(yīng)性T細(xì)胞的抑制作用。
　　 由此，銀屑病患者中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞是否存在數(shù)量的改變?是否存在Th17/Treg失衡?IL-21是如何發(fā)揮對Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞調(diào)節(jié)作用的?我們的實驗便是圍繞這幾個問題展開的。

4、
　　 本研究通過不同的方法從mRNA水平和蛋白水平證實在銀屑病患者外周血和皮膚組織中存在過度活化的Th17細(xì)胞，Th17細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，而外周血和皮膚組織中Treg細(xì)胞數(shù)量減少，出現(xiàn)了Th17/Treg的失衡。同時從不同的水平證實了在銀屑病患者外周血和皮損中存在高于健康對照者的IL-21和IL-21R，通過CD4+T細(xì)胞與IL-21的共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)IL-21能夠促進(jìn)銀屑病患者外周血Th17細(xì)胞的分化，抑制了Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄

5、因子foxp3的表達(dá)，從而降低Treg細(xì)胞的活性。由此我們可以推測使用IL-21R/Fc融合蛋白或IL-21單抗可以拮抗IL-21，從而抑制Th17細(xì)胞分化及增強Treg細(xì)胞的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)體內(nèi)Treg/Th17平衡，最終實現(xiàn)控制炎癥、治療銀屑病。因此，本實驗的結(jié)果為將來在臨床上實施靶向性阻斷IL-21R信號治療銀屑病奠定了重要的理論基礎(chǔ)。
　　 第一部分銀屑病患者外周血、皮膚組織Th17細(xì)胞的實驗研究
　　 目的：探討

6、Th17細(xì)胞在銀屑病患者外周血PBMC、皮膚組織的變化情況，明確Th17細(xì)胞與銀屑病的可能關(guān)系。
　　 方法：用流式細(xì)胞儀檢測58例銀屑病患者及20例健康對照者外周血中Th17細(xì)胞的百分率；用實時定量PCR(real-time PCR)檢測外周血和皮膚組織中Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)情況；用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測培養(yǎng)上清中IL-17、IL-22的分泌水平；用免疫組織化學(xué)檢測IL-17在25例銀屑病患者及1

7、5例健康對照者皮膚組織中表達(dá)情況；用激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal)檢測Th17細(xì)胞在皮膚組織中的分布情況。
　　 結(jié)果：通過流式細(xì)胞儀檢測到了銀屑病患者Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率明顯高于健康對照者；免疫組織化學(xué)和激光掃描共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)銀屑病皮損組織中有CD4+IL17+的淋巴細(xì)胞浸潤，而正常人皮膚組織中較少；PBMC培養(yǎng)上清中的IL-17和IL-22分泌水平增加；Real-time PCR發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞相

8、關(guān)細(xì)胞因子IL-17A、RORC、IL-23A和IL-22mRNA以及Th1相關(guān)因子IFN-γmRNA在銀屑病患者的PBMC和皮膚組織中表達(dá)均較健康對照組增高，Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-4在PBMC中表達(dá)沒有差異，但在皮膚組織中表達(dá)有顯著差異。
　　 結(jié)論：銀屑病患者外周血和皮膚組織中存在過度表達(dá)的Th17細(xì)胞，Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子可能與銀屑病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　 第二部分銀屑病患者外周血PBMC、皮膚組織Tre

9、g細(xì)胞的實驗研究
　　 目的：探討Treg細(xì)胞及其轉(zhuǎn)錄因子Foxp3在銀屑病患者外周血和皮膚組織的變化情況，明確Treg細(xì)胞與銀屑病的關(guān)系。
　　 方法：用流式細(xì)胞儀檢測58例銀屑病患者及20例健康對照者外周血中Treg細(xì)胞的百分率；用real-time PCR檢測外周血和皮膚組織中Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3mRNA的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：流式細(xì)胞儀的檢測發(fā)現(xiàn)銀屑病患者外周血PBMC中CD4+CD25+Fo

10、xp3+細(xì)胞的百分率低于正常對照組，同時real-time PCR示Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3mRNA在銀屑病患者外周血PBMC和皮膚組織表達(dá)較正常對照組降低。分析發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例與Treg細(xì)胞CD4+T細(xì)胞的比例成負(fù)相關(guān)。
　　 結(jié)論：銀屑病患者外周血Treg細(xì)胞的比例降低，與Th17細(xì)胞的比例成負(fù)相關(guān)。Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)的降低及Treg細(xì)胞對Th17細(xì)胞抑制作用的減弱可能是銀屑病的發(fā)

11、病機制之一。
　　 第三部分 IL-21、IL-21R在銀屑病發(fā)病中作用的實驗研究
　　 目的：研究IL-21、IL-21R在銀屑病患者外周血iPBMC和皮膚組織中的表達(dá)情況。
　　 方法：流式細(xì)胞儀檢測58例銀屑病患者及20例健康對照者外周血中PBMC中IL-21+CD4+、IL-21R+CD4+細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率；Real-time PCR檢測外周血和皮膚組織中IL-21、IL-21RmRNA的表達(dá)

12、情況；Western-Blot檢測皮膚組織中IL-21和IL-21R表達(dá)情況；ELISA檢測PBMC培養(yǎng)上清中IL-21的分泌水平；免疫組織化學(xué)檢測IL-21、IL-21R在皮膚組織中的表達(dá)情況；激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal)檢測IL-21在皮膚組織中的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)銀屑病患者PBMC中IL-21+CD4+、IL-21R+CD4+細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率明顯增加；Real-time PC

13、R發(fā)現(xiàn)IL-21、IL-21RmRNA在銀屑病患者PBMC和皮膚組織中表達(dá)均較健康對照者增高；ELISA檢測發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)上清中IL-21分泌水平增加；免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)IL-21、IL-21R在銀屑病患者皮損組織內(nèi)表達(dá)比健康對照組明顯增高；Western-Blot示IL-21和IL-21R蛋白在銀屑病患者的皮損中表達(dá)增高；激光掃描共聚焦顯微鏡顯示銀屑病患者皮損組織中有CD4+IL-21+的淋巴細(xì)胞浸潤，而正常人皮膚組織中較少。
　　

14、 結(jié)論：IL-21、IL-21R在銀屑病患者的外周血PBMC和皮損組織中表達(dá)增加。
　　 第四部分 IL-21對銀屑病Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用的研究
　　 目的：研究IL-21對銀屑病Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　 方法：分離CD4+T細(xì)胞，在IL-21的存在下體外細(xì)胞培養(yǎng)72h，流式細(xì)胞儀檢測30例銀屑病患者及15例健康對照者CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)72h后Th17細(xì)胞的變化情況；

15、CFSE標(biāo)記細(xì)胞檢測IL-21對銀屑病患者Th17細(xì)胞增殖的影響；Real-time PCR檢測IL-21刺激后IL-17A、Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子RORC以及Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3mRNA的表達(dá)情況；ELISA檢測CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17和IL-22的分泌水平。
　　 結(jié)果：流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)銀屑病患者和正常對照者的CD4+T細(xì)胞加入IL-21后IL-17+細(xì)胞的比例明顯高于未加入IL-21組；Real-tim

16、e PCR檢測IL-21刺激后IL-17A和RORC的表達(dá)明顯高于未刺激組，而Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)明顯低于未刺激組；CFSE示IL-21刺激后誘導(dǎo)了CD4+T細(xì)胞的增殖分化；加入IL-21后，銀屑病患者CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17和IL-22分泌水平增加。
　　 結(jié)論：IL-21促進(jìn)銀屑病患者外周血Th17細(xì)胞的分化，同時抑制了Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子foxp3的表達(dá)，降低了Treg細(xì)胞的活性，破壞Treg