IL-21對(duì)銀屑病Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的研究.pdf

1、銀屑病是一種嚴(yán)重危害人類健康的自身免疫性疾病，是在多基因遺傳背景下由T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性、復(fù)發(fā)性疾病，病人機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂，造成臨床上典型的皮膚鱗屑性炎癥病變。但到目前為止，對(duì)其發(fā)生的免疫學(xué)機(jī)制尚不完全清楚，因此，進(jìn)一步探索研究新的T細(xì)胞亞群與銀屑病發(fā)生的關(guān)系，以及細(xì)胞因子對(duì)T細(xì)胞亞群的調(diào)節(jié)作用，對(duì)深入揭示銀屑病發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制、尋找新的治療靶標(biāo)和藥物、防治銀屑病都具有重大的意義。
　　 免疫自穩(wěn)對(duì)防止自身免疫性疾病的發(fā)生和維持體內(nèi)

2、免疫平衡發(fā)揮了重要的作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells，Treg細(xì)胞)具有免疫抑制作用，在外周免疫耐受中起關(guān)鍵作用。Th17細(xì)胞是最近新發(fā)現(xiàn)的一群產(chǎn)生IL-17的輔助型T細(xì)胞，而IL-17是一種強(qiáng)大的前炎癥性細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)炎癥發(fā)生和組織損傷，加重自身免疫性疾病的發(fā)生。Treg細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞之間的相互作用對(duì)于維持有效的免疫反應(yīng)和病理?yè)p傷的平衡至關(guān)重要。同時(shí)在T淋巴細(xì)胞亞群的分化和作用中，各種細(xì)胞因子發(fā)揮著不可替代的

3、作用。IL-21R在組織細(xì)胞上的廣泛表達(dá)引起了學(xué)者對(duì)IL-21的關(guān)注，研究提示，IL-21通過(guò)一些重要的免疫細(xì)胞發(fā)揮作用，IL-21能夠調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞活化和增殖，抑制Treg細(xì)胞的分化及抵抗Treg細(xì)胞對(duì)效應(yīng)性T細(xì)胞的抑制作用。
　　 由此，銀屑病患者中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞是否存在數(shù)量的改變?是否存在Th17/Treg失衡?IL-21是如何發(fā)揮對(duì)Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞調(diào)節(jié)作用的?我們的實(shí)驗(yàn)便是圍繞這幾個(gè)問(wèn)題展開(kāi)的。

4、
　　 本研究通過(guò)不同的方法從mRNA水平和蛋白水平證實(shí)在銀屑病患者外周血和皮膚組織中存在過(guò)度活化的Th17細(xì)胞，Th17細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，而外周血和皮膚組織中Treg細(xì)胞數(shù)量減少，出現(xiàn)了Th17/Treg的失衡。同時(shí)從不同的水平證實(shí)了在銀屑病患者外周血和皮損中存在高于健康對(duì)照者的IL-21和IL-21R，通過(guò)CD4+T細(xì)胞與IL-21的共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)IL-21能夠促進(jìn)銀屑病患者外周血Th17細(xì)胞的分化，抑制了Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄

5、因子foxp3的表達(dá)，從而降低Treg細(xì)胞的活性。由此我們可以推測(cè)使用IL-21R/Fc融合蛋白或IL-21單抗可以拮抗IL-21，從而抑制Th17細(xì)胞分化及增強(qiáng)Treg細(xì)胞的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)體內(nèi)Treg/Th17平衡，最終實(shí)現(xiàn)控制炎癥、治療銀屑病。因此，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為將來(lái)在臨床上實(shí)施靶向性阻斷IL-21R信號(hào)治療銀屑病奠定了重要的理論基礎(chǔ)。
　　 第一部分銀屑病患者外周血、皮膚組織Th17細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：探討

6、Th17細(xì)胞在銀屑病患者外周血PBMC、皮膚組織的變化情況，明確Th17細(xì)胞與銀屑病的可能關(guān)系。
　　 方法：用流式細(xì)胞儀檢測(cè)58例銀屑病患者及20例健康對(duì)照者外周血中Th17細(xì)胞的百分率；用實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)檢測(cè)外周血和皮膚組織中Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)情況；用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-17、IL-22的分泌水平；用免疫組織化學(xué)檢測(cè)IL-17在25例銀屑病患者及1

7、5例健康對(duì)照者皮膚組織中表達(dá)情況；用激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal)檢測(cè)Th17細(xì)胞在皮膚組織中的分布情況。
　　 結(jié)果：通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)到了銀屑病患者Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率明顯高于健康對(duì)照者；免疫組織化學(xué)和激光掃描共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)銀屑病皮損組織中有CD4+IL17+的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，而正常人皮膚組織中較少；PBMC培養(yǎng)上清中的IL-17和IL-22分泌水平增加；Real-time PCR發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞相

8、關(guān)細(xì)胞因子IL-17A、RORC、IL-23A和IL-22mRNA以及Th1相關(guān)因子IFN-γmRNA在銀屑病患者的PBMC和皮膚組織中表達(dá)均較健康對(duì)照組增高，Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-4在PBMC中表達(dá)沒(méi)有差異，但在皮膚組織中表達(dá)有顯著差異。
　　 結(jié)論：銀屑病患者外周血和皮膚組織中存在過(guò)度表達(dá)的Th17細(xì)胞，Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子可能與銀屑病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　 第二部分銀屑病患者外周血PBMC、皮膚組織Tre

9、g細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：探討Treg細(xì)胞及其轉(zhuǎn)錄因子Foxp3在銀屑病患者外周血和皮膚組織的變化情況，明確Treg細(xì)胞與銀屑病的關(guān)系。
　　 方法：用流式細(xì)胞儀檢測(cè)58例銀屑病患者及20例健康對(duì)照者外周血中Treg細(xì)胞的百分率；用real-time PCR檢測(cè)外周血和皮膚組織中Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3mRNA的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：流式細(xì)胞儀的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)銀屑病患者外周血PBMC中CD4+CD25+Fo

10、xp3+細(xì)胞的百分率低于正常對(duì)照組，同時(shí)real-time PCR示Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3mRNA在銀屑病患者外周血PBMC和皮膚組織表達(dá)較正常對(duì)照組降低。分析發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例與Treg細(xì)胞CD4+T細(xì)胞的比例成負(fù)相關(guān)。
　　 結(jié)論：銀屑病患者外周血Treg細(xì)胞的比例降低，與Th17細(xì)胞的比例成負(fù)相關(guān)。Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)的降低及Treg細(xì)胞對(duì)Th17細(xì)胞抑制作用的減弱可能是銀屑病的發(fā)

11、病機(jī)制之一。
　　 第三部分 IL-21、IL-21R在銀屑病發(fā)病中作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：研究IL-21、IL-21R在銀屑病患者外周血iPBMC和皮膚組織中的表達(dá)情況。
　　 方法：流式細(xì)胞儀檢測(cè)58例銀屑病患者及20例健康對(duì)照者外周血中PBMC中IL-21+CD4+、IL-21R+CD4+細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率；Real-time PCR檢測(cè)外周血和皮膚組織中IL-21、IL-21RmRNA的表達(dá)

12、情況；Western-Blot檢測(cè)皮膚組織中IL-21和IL-21R表達(dá)情況；ELISA檢測(cè)PBMC培養(yǎng)上清中IL-21的分泌水平；免疫組織化學(xué)檢測(cè)IL-21、IL-21R在皮膚組織中的表達(dá)情況；激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal)檢測(cè)IL-21在皮膚組織中的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)銀屑病患者PBMC中IL-21+CD4+、IL-21R+CD4+細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率明顯增加；Real-time PC

13、R發(fā)現(xiàn)IL-21、IL-21RmRNA在銀屑病患者PBMC和皮膚組織中表達(dá)均較健康對(duì)照者增高；ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)上清中IL-21分泌水平增加；免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)IL-21、IL-21R在銀屑病患者皮損組織內(nèi)表達(dá)比健康對(duì)照組明顯增高；Western-Blot示IL-21和IL-21R蛋白在銀屑病患者的皮損中表達(dá)增高；激光掃描共聚焦顯微鏡顯示銀屑病患者皮損組織中有CD4+IL-21+的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，而正常人皮膚組織中較少。
　　

14、 結(jié)論：IL-21、IL-21R在銀屑病患者的外周血PBMC和皮損組織中表達(dá)增加。
　　 第四部分 IL-21對(duì)銀屑病Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用的研究
　　 目的：研究IL-21對(duì)銀屑病Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　 方法：分離CD4+T細(xì)胞，在IL-21的存在下體外細(xì)胞培養(yǎng)72h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)30例銀屑病患者及15例健康對(duì)照者CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)72h后Th17細(xì)胞的變化情況；

15、CFSE標(biāo)記細(xì)胞檢測(cè)IL-21對(duì)銀屑病患者Th17細(xì)胞增殖的影響；Real-time PCR檢測(cè)IL-21刺激后IL-17A、Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子RORC以及Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3mRNA的表達(dá)情況；ELISA檢測(cè)CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17和IL-22的分泌水平。
　　 結(jié)果：流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)銀屑病患者和正常對(duì)照者的CD4+T細(xì)胞加入IL-21后IL-17+細(xì)胞的比例明顯高于未加入IL-21組；Real-tim

16、e PCR檢測(cè)IL-21刺激后IL-17A和RORC的表達(dá)明顯高于未刺激組，而Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)明顯低于未刺激組；CFSE示IL-21刺激后誘導(dǎo)了CD4+T細(xì)胞的增殖分化；加入IL-21后，銀屑病患者CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17和IL-22分泌水平增加。
　　 結(jié)論：IL-21促進(jìn)銀屑病患者外周血Th17細(xì)胞的分化，同時(shí)抑制了Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子foxp3的表達(dá)，降低了Treg細(xì)胞的活性，破壞Treg