外周血單個核細(xì)胞MHC基因表達(dá)與早期急性移植排斥的研究.pdf

1、器官和組織移植是20世紀(jì)最重要的醫(yī)學(xué)成就之一，目前移植術(shù)已成為組織、器官功能衰竭終末階段最有效的治療措施。同種異基因移植是臨床最常見的移植類型，無論何種移植，只要移植物表達(dá)與受者不同的蛋白質(zhì)或其他分子，移植物就會被排斥。如何早期診斷排斥反應(yīng)，是臨床醫(yī)生面臨的重要問題。 目前臨床上觀察急性排斥反應(yīng)主要依據(jù)病人的癥狀，特別是移植臟器的功能指標(biāo)或活體穿刺，無論何種手段，發(fā)現(xiàn)都晚，延誤了時機(jī)。正在研究的與急性排斥反應(yīng)有關(guān)的指標(biāo)，例如CD

2、4+或CD8+T淋巴細(xì)胞檢測，IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子檢測，以及蛋白、酶類、補(bǔ)體和sOD30檢測等，它們在敏感性、特異性和移植排斥早期檢測上都存在一定的缺陷。現(xiàn)在仍未找到公認(rèn)的、無創(chuàng)傷性的、敏感性和特異性均足以應(yīng)用于臨床監(jiān)測的指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)的研究目的主要是尋找更好的移植排斥檢測指標(biāo)。 外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood morlonuclear cell，PBMC)主要為淋巴

3、細(xì)胞和單核細(xì)胞，其中絕大多數(shù)為淋巴細(xì)胞。MHC-I類分子幾乎存在于所有有核細(xì)胞，外周血淋巴細(xì)胞表達(dá)MHC-I類抗原量最多，現(xiàn)已確定，移植排斥反應(yīng)所識別的耙抗原主要是表達(dá)于移植物細(xì)胞表面的MHC分子，MHC在移植中具有重要的作用，器官移植后發(fā)生急性排斥反應(yīng)時宿主MHC有何變化?這方面很少有人研究，由于外周血比較容易檢測，因此我們以外周血單個核細(xì)胞MHC代表宿主MHC來研究急性移植排斥反應(yīng)時宿主MHC變化，希望能找到更好的移植排斥檢測指標(biāo)。

4、 MHCⅠ和MHC Ⅱ基因mRNA相對定量表達(dá)結(jié)果表明，對照組移植前后MHCⅠ和MHC Ⅱ基因mRNA表達(dá)均沒有明顯變化。MHCⅠ基因mRNA表達(dá)在應(yīng)用免疫抑制劑組呈上升趨勢，但上升緩慢，到肉眼可見排斥時，達(dá)到最高值，未用免疫抑制劑組表達(dá)變化不明顯。MHC Ⅱ基因mRNA表達(dá)在應(yīng)用免疫抑制劑和未用免疫抑制劑組表達(dá)趨勢基本一致，即在肉眼可見排斥反應(yīng)前2-3天達(dá)迅速達(dá)到最高值，隨后下降。 另外我們也檢測了綠膿桿菌感染后血常規(guī)

5、和MHC基因mRNA表達(dá)的變化。8只新西蘭白兔隨機(jī)分成兩組，對照組3只，實(shí)驗(yàn)組5只。實(shí)驗(yàn)組5只新西蘭白兔于實(shí)驗(yàn)前1天皮下注射綠膿桿菌，綠膿桿菌濃度為5×109CU。對照組3只新西蘭白兔實(shí)驗(yàn)前1天皮下注射相同體積的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)持續(xù)8天。術(shù)后每2天無菌抽取實(shí)驗(yàn)兔外周血1ml，先檢測血常規(guī)，剩余抗凝血用于分離外周血單個核細(xì)胞，應(yīng)用實(shí)時定量PCR儀測定MHCⅠ和MHCⅡ基因mRNA的表達(dá)。 結(jié)果表明：對照組注射前后白細(xì)胞總數(shù)和中性細(xì)胞

6、數(shù)沒有明顯變化。實(shí)驗(yàn)組注射綠膿桿菌后白細(xì)胞總數(shù)和中性細(xì)胞數(shù)明顯升高。對照組注射前后PBMC MHCI和MHC Ⅱ mRNA表達(dá)無明顯變化。實(shí)驗(yàn)組注射綠膿桿菌后PBMC MHCⅠ和MHC ⅡmRNA表達(dá)較對照組明顯升高。 細(xì)菌感染目前臨床上已經(jīng)很容易發(fā)現(xiàn)和檢測，血常規(guī)中白細(xì)胞總數(shù)、中性細(xì)胞數(shù)和中性細(xì)胞數(shù)的比率升高反應(yīng)急性細(xì)菌感染。而急性移植排斥反應(yīng)發(fā)生時，對照組、實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組實(shí)驗(yàn)前后血常規(guī)中白細(xì)胞總數(shù)和中性細(xì)胞數(shù)無明顯變化。

7、因此我們認(rèn)為，利用外周血單個核細(xì)胞MHC基因mRNA表達(dá)檢測急性排斥反應(yīng)同時，檢測血常規(guī)，如果血常規(guī)沒有明顯的白細(xì)胞總數(shù)、中性細(xì)胞數(shù)和中性細(xì)胞數(shù)的比率升高，而外周血單個核細(xì)胞MHC基因mRNA表達(dá)升高時，可以排除細(xì)菌感染引起的MHC基因mRNA表達(dá)升高，診斷為急性移植排斥。由于大部分病毒尤其是巨細(xì)胞病毒感染后，外周血單個核細(xì)胞表面表達(dá)MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子降低，這樣如果檢測到MHC基因mRNA表達(dá)升高，基本可以排除病毒感染，診斷為急

8、性移植排斥。 在環(huán)孢素影響宿主MHC基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中，13只新西蘭白兔隨機(jī)分成三組，對照組3只，低劑量環(huán)孢素組5只，大劑量環(huán)孢素組5只。低劑量環(huán)孢素組每天肌肉注射環(huán)孢素(5m g/kg)，大劑量環(huán)孢素組每天肌肉注射環(huán)孢素(20m g/kg)，對照組3只新西蘭白兔每天肌肉注射相同體積的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)持續(xù)30天。實(shí)驗(yàn)開始前和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時抽血，測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮和血肌酐。每隔5天無菌抽取實(shí)驗(yàn)兔外周血1ml，分離單個核細(xì)胞

9、，應(yīng)用實(shí)時定量PCR儀測定MHCⅠ和MHCⅡ基因mRNA的表達(dá)。第30天實(shí)驗(yàn)結(jié)束取實(shí)驗(yàn)新西蘭白兔肝臟、脾臟、腎臟和胸腺少許，應(yīng)用實(shí)時定量PCR儀測定MHC Ⅰ和MHC Ⅱ基因mRNA的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)30天結(jié)束時，大劑量環(huán)孢素組新西蘭白兔谷丙轉(zhuǎn)氨酶：實(shí)驗(yàn)前平均35iU/L，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時平均73IU/L；谷草轉(zhuǎn)氨酶：實(shí)驗(yàn)前平均38IU/L，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時平均78IU/L；尿素氮：實(shí)驗(yàn)前平均6.13mmol/L，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時平均21.72mmol/1；血

10、肌酐：實(shí)驗(yàn)前平均62μmol/L，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時平均274μmol/L。低劑量環(huán)孢素組(5mg/kg)和對照組實(shí)驗(yàn)前后沒有明顯變化。實(shí)驗(yàn)30天結(jié)束時，對照組和低劑量環(huán)孢素組新西蘭白兔肝臟和腎臟病理檢查無明顯變化。大劑量環(huán)孢素組新西蘭白兔肝臟呈急性環(huán)孢霉素中毒，包括肝內(nèi)膽管淤膽、肝血管內(nèi)紅細(xì)胞增多和肝細(xì)胞氣球樣變性。大劑量環(huán)孢素組新西蘭白兔腎臟呈急性環(huán)孢霉素中毒，包括管周毛細(xì)血管紅細(xì)胞增多和近端腎小管上皮細(xì)胞等立方的空泡變性。以上血生化和病理

11、檢查證明大劑量環(huán)孢素(20mg/kg)已造成實(shí)驗(yàn)兔肝臟和腎臟損，所應(yīng)用的環(huán)孢素劑量(20mg/kg)確實(shí)是大劑量。 MHC分子mRNA表達(dá)結(jié)果表明，低劑量環(huán)孢素組和大劑量環(huán)孢素組外周血單個核細(xì)胞MHC Ⅰ和MHC Ⅱ表達(dá)在5-10天時呈顯著上升趨勢，15天后直到30天實(shí)驗(yàn)結(jié)束，MHC Ⅰ和MHC Ⅱ表達(dá)又下降到最初用藥前水平。實(shí)驗(yàn)30天結(jié)束時宿主臟器(肝臟、脾臟、腎臟和胸腺)MHC Ⅰ和MHC Ⅱ表達(dá)沒有明顯變化。 我們

12、的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和Lim SW的一樣，應(yīng)用環(huán)孢素后能增加MHC基因的表達(dá)。但這種增加是一過性的，只是在應(yīng)用環(huán)孢素的第5-10天左右，隨著用藥時間延長，并不能連續(xù)增加MHC基因的表達(dá)。宿主各臟器應(yīng)用用環(huán)孢素后，可能也是一過性地增加MHC基因的表達(dá)，由于我們是在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時取各臟器測定，它們的升高趨勢已經(jīng)結(jié)束，因此與對照組相比無明顯變化。 環(huán)孢素抑制排斥反應(yīng)是因?yàn)榄h(huán)孢素與胞內(nèi)的環(huán)孢親和素結(jié)為復(fù)合體，后者與鈣調(diào)磷酸酶結(jié)合并抑制其酶活性，通過抑

13、制胞漿NT-AT向胞核內(nèi)移動，而干擾IL-2轉(zhuǎn)錄，最終阻斷IL-2依賴性T細(xì)胞生長和分化。我們的實(shí)驗(yàn)表明，環(huán)孢素能一過性增加MHC基因的表達(dá)，可能的原因是環(huán)孢素引起某些細(xì)胞因子的升高，需要以后來證明。這是第一次提出關(guān)于環(huán)孢素能一過性增加MHC基因表達(dá)的結(jié)論。 糖皮質(zhì)激素作為免疫抑制藥物用于臨床器官移植的歷史已經(jīng)很長。目前認(rèn)為它的作用機(jī)制是抑制移植免疫活性細(xì)胞在“識別階段”向移植器官集聚并使其裂解，阻止了它們對移植器官上免疫抗原的

14、識別。 我們以新西蘭白兔進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用實(shí)時定量RT—PCR的方法，系統(tǒng)全面研究新西蘭白兔服用大劑量強(qiáng)的松后外周血單個核細(xì)胞和機(jī)體各臟器MHC分子mRNA表達(dá)變化情況。8 R新西蘭白兔隨機(jī)分成兩組，實(shí)驗(yàn)組5只，對照組3只。實(shí)驗(yàn)組5只新西蘭白兔每天用理鹽水溶解的強(qiáng)的松(20mg/kg)灌胃，對照組3只新西蘭白兔每天以相同體積的生理鹽水灌胃。實(shí)驗(yàn)組和對照組新西蘭白兔連續(xù)灌胃8天。第4天和第8無菌抽取實(shí)驗(yàn)兔外周血1ml，分離單個核細(xì)

15、胞，應(yīng)用實(shí)時定量PCR儀測定MHC Ⅰ和MHCⅡ基因mRNA的表達(dá)。第8天實(shí)驗(yàn)結(jié)束取實(shí)驗(yàn)新西蘭白兔肝臟、脾臟、。腎臟和胸腺少許，應(yīng)用實(shí)時定量PCR儀測定MHC Ⅰ和MHCⅡ基因mRNA的表達(dá)。結(jié)果表明：外周血單個核細(xì)胞MHC Ⅰ基因表達(dá)在第4天和第8天明顯降低，MHC Ⅱ基因mRNA表達(dá)用藥后第4天下降，第8天明顯降低；宿主各臟器包括肝臟、脾臟、腎臟和胸腺用藥結(jié)束后MHC Ⅰ和MHC Ⅱ基因mRNA表達(dá)均較對照組降低。相比較而言，外周血

16、單個核細(xì)胞在用藥結(jié)束后MHC Ⅰ和MHC ll基因mRNA表達(dá)降低比宿主各臟器更明顯。 GⅠulⅠanⅠ C研究表明，糖皮質(zhì)激素降低大鼠胸腺M(fèi)HC Ⅰ基因表達(dá)。更早的研究表明，強(qiáng)的松抑制小鼠巨噬細(xì)胞MHCⅡ基因表達(dá)。我們的研究表明，糖皮質(zhì)激素藥物強(qiáng)的松能廣泛降低宿主各臟器MHC Ⅰ和MHC Ⅱ基因mRNA表達(dá)，而降低外周血單個核細(xì)胞MHC Ⅰ和MHC Ⅱ基因mRNA表達(dá)更明顯。因此認(rèn)為可以用外周血單個核細(xì)胞代表宿主各臟器來研究宿