急性移植排斥反應(yīng)過程中MHC-1表達變化的實驗研究與臨床應(yīng)用.pdf

1、背景:器官移植是20世紀(jì)偉大的科學(xué)創(chuàng)舉，器官移植的廣泛開展挽救了無數(shù)終末期器官功能衰竭患者的生命。然而，器官移植技術(shù)仍存在諸多問題，使得移植后的器官不能正常發(fā)揮功能。移植后的急性排斥反應(yīng)(AGR)是移植物功能降低甚至喪失的主要原因，也是導(dǎo)致慢性排斥反應(yīng)的主要因素。盡早及時的發(fā)現(xiàn)急性排斥反應(yīng)，并采取有效的措施加以控制，可挽救移植物或延長移植物壽命。
　　 目前移植物的病理組織學(xué)檢查仍然是判斷急性排斥反應(yīng)的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，由于病理組織

2、學(xué)檢查存在創(chuàng)傷性、操作復(fù)雜、費用昂貴、不適合重復(fù)操作等缺點，不能作為臨床常規(guī)檢查手段。目前常用的一些無創(chuàng)性檢查方法，包括影像學(xué)、生化學(xué)檢查以及抗體檢測等，由于其在準(zhǔn)確性、敏感性、特異性方面的不足而沒能廣泛應(yīng)用于臨床。至今為止，沒有一種用于判斷急性排斥反應(yīng)的簡單、無創(chuàng)性的檢查方法獲得大家的認(rèn)可。
　　 主要組織相容性復(fù)合體(MHC)，是位于哺乳動物某一染色體的一組緊密連鎖的基因群，其產(chǎn)物的主要作用是參與抗原遞呈和T細胞激活，在免疫

3、應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)中執(zhí)行重要而廣泛的功能。人類MHC又稱人類白細胞抗原復(fù)合體(HLA)。經(jīng)典的MHC分子具有高度的多態(tài)性，正是由于移植供受者間這種MHC分子的不匹配導(dǎo)致了移植排斥反應(yīng)的發(fā)生。也就是說MHC是啟動移植排斥反應(yīng)的靶抗原，是移植免疫的主角。在移植免疫研究領(lǐng)域，人們往往把目光集中在移植物MHC分子以及宿主血清中針對移植物的抗體上。但作為體內(nèi)表達MHC-Ⅰ類分子最豐富的細胞，淋巴細胞尤其是T淋巴細胞MHC-Ⅰ類分子的功能研究卻較少見。

4、已有研究表明，外周血淋巴細胞表面HLA-A、B mRNA以及其相應(yīng)蛋白的表達隨年齡老化而降低，可以作為機體免疫功能衰退的指標(biāo)：CD4+T細胞表面MHC-Ⅰ類分子可以延長CD4+T細胞的存活時間；記憶性T細胞表面MHC-Ⅰ類分子的表達對其自身具有保護作用。前期工作利用RNAi技術(shù)封閉淋巴細胞表面MHC-Ⅰ分子，發(fā)現(xiàn)淋巴細胞的增殖和殺傷活性均降低。另外前期對近交系小鼠皮膚移植模型的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)生急性排斥反應(yīng)時小鼠外周血淋巴細胞MHC-Ⅰ基

5、因中的H-2K、H-2D基因轉(zhuǎn)錄mRNA表達升高。那么MHC-Ⅰ蛋白作為行使功能的分子，與急性排斥反應(yīng)的關(guān)系如何?以及其在臨床上的應(yīng)用如何?CD4+T細胞和CD8+T細胞哪個亞群細胞表面MHC-Ⅰ的表達更能代表急性排斥反應(yīng)的發(fā)生?MHC-Ⅰ蛋白和MHC-ⅠmRNA兩者誰更利于急性排斥反應(yīng)的早期發(fā)現(xiàn)?類似問題有待于進一步研究。
　　 為了系統(tǒng)的研究MHC-Ⅰ分子在急性移植排斥反應(yīng)全過程中的變化規(guī)律，本研究首先采用近交系小鼠皮膚移植

6、模型，研究了移植前、移植后不同時間點小鼠外周血淋巴細胞MHC-ⅠmRNA的表達及外周血CD4+、CD8+T細胞亞群MHC-Ⅰ、移植物MHC-Ⅰ分子的表達變化，分析了MHC-Ⅰ分子的表達水平與移植排斥全過程的對應(yīng)關(guān)系。進而動態(tài)監(jiān)測了臨床上包括移植術(shù)后穩(wěn)定和移植術(shù)后發(fā)生急性排斥的共53例腎移植患者外周血CD4+、CD8+T細胞MHC-Ⅰ分子的表達情況，從動物和臨床兩方面探討了MHC-Ⅰ作為判斷急性移植排斥反應(yīng)指標(biāo)的可行性。
　　 目

7、的:
　　 1.構(gòu)建近交系小鼠皮膚移植模型，從而獲得急性移植排斥反應(yīng)的全過程，研究急性移植排斥反應(yīng)時外周血淋巴細胞MHC-Ⅰ的表達規(guī)律，探討外周血淋巴細胞MHC-I表達與急性移植排斥反應(yīng)病理分級之間的對應(yīng)關(guān)系。
　　 2.對外周血淋巴細胞MHC-Ⅰ基因的mRNA和蛋白兩個水平進行研究，分析兩水平表達趨勢是否一致，哪一個水平的表達變化更能反映急性移植排斥反應(yīng)。
　　 3.分別檢測CD3+CD4+T細胞和CD3+CD

8、8+T細胞表面MHC-Ⅰ分子的表達變化，分析MHC-Ⅰ分子的表達變化在兩群細胞間是否存在差別。
　　 4.與T細胞活化指標(biāo)MHC-Ⅱ比較，探討MHC-Ⅰ分子作為判斷急性移植排斥反應(yīng)的可行性。
　　 5.動態(tài)檢測腎移植患者術(shù)前和術(shù)后不同時間外周血單個核細胞HLA-Ⅰ mRNA表達變化以及CD3+CD4+細胞和CD3+CD8+細胞HLA-Ⅰ蛋白水平的表達變化，對比排斥組和穩(wěn)定組之間的差異，進一步探討在臨床腎急性移植排斥反應(yīng)中

9、HLA-Ⅰ的診斷價值。
　　 方法:
　　 1.實驗小鼠分組：把270只BALB/C(簡稱BA)小鼠隨機分為三組，分別是移植用藥組(應(yīng)用免疫抑制劑)、移植未用藥組以及單純感染組。用藥組和未用藥組又分為非手術(shù)組、同系移植組和異系移植組。用藥非手術(shù)組即為用藥術(shù)前對照組，未用藥非手術(shù)組即為未用藥術(shù)前對照組。用藥組的設(shè)立是為了模擬臨床采用了皮質(zhì)激素(Horm)、環(huán)孢素A(CsA)及霉酚酸酯(MMF)中等劑量三聯(lián)用藥。
　　

10、 采用腸球菌注射正常小鼠腹腔建立腸球菌小鼠腹膜炎模型既為細菌感染組。同系移植采用BA小鼠個體之間進行皮膚移植，異系移植以C57BL/6(簡稱C57)小鼠為供體，BA小鼠為受體，進行小鼠皮膚移植。每兩天為一個時間點，分別為術(shù)后2、4、6天……，用藥移植組小鼠觀察到術(shù)后26天，未用藥移植組小鼠觀察到術(shù)后16天。
　　 2.構(gòu)建小鼠皮膚移植模型以及標(biāo)本的留?。阂訡57小鼠為供體，BA小鼠為受體，采用經(jīng)典的小鼠背一背皮膚移植手術(shù)方法，

11、建立小鼠皮膚移植動物模型。移植后每隔一天(每兩天)對小鼠狀態(tài)進行全面分析，每個時間點6只小鼠，進行以下操作：記錄移植前和移植術(shù)后各時間點小鼠移植皮片的肉眼變化；通過眼球取血采集小鼠血液到EDTA-K2抗凝血常規(guī)管中備用；采血的同時取移植皮片組織用4％多聚甲醛固定，用于組織病理學(xué)檢測和免疫組化檢測。對正常組和細菌感染組小鼠收集血液備用。
　　 3.小鼠血液標(biāo)本的檢測：采用三色流式細胞技術(shù)檢測小鼠外周血不同亞群T細胞：CD3+CD4

12、+T細胞、CD3+CD8+T細胞表面MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ分子的表達；采用實時熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測小鼠外周血淋巴細胞MHC-Ⅰ mRNA、MHC-ⅡmRNA的表達變化：分析外周血淋巴細胞MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ在AGR全過程中的變化規(guī)律，以及免疫抑制劑對上述指標(biāo)表達水平的影響。
　　 4.小鼠移植皮片標(biāo)本的檢查：對留取的所有時間點的皮膚組織進行常規(guī)病理切片，H-E染色后觀察移植皮片淋巴細胞浸潤等組織學(xué)變化，根據(jù)病理組織學(xué)改

13、變將術(shù)后不同天數(shù)的移植物排斥反應(yīng)發(fā)生的程度分為Ⅰ-Ⅳ級，記錄移植物病理排斥動態(tài)變化。對比用藥和不用藥對移植物病理組織學(xué)改變和存活時間的影響。采用免疫組織化學(xué)染色法檢測小鼠移植皮片中組織細胞和浸潤淋巴細胞MHC-Ⅰ的表達，觀察急性移植排斥反應(yīng)發(fā)生時小鼠移植皮片中MHC-Ⅰ表達強度的變化。
　　 5.臨床腎移植患者：根據(jù)移植術(shù)后3個月之內(nèi)是否發(fā)生過急性移植排斥反應(yīng)，把腎移植患者分成穩(wěn)定組和排斥組。收集腎移植穩(wěn)定組患者術(shù)前和術(shù)后3天、

14、7天……3月和大于3個月的血液標(biāo)本和腎移植排斥組患者排斥前、排斥當(dāng)天、抗排斥治療后3天、7天、14天的血液標(biāo)本，采用流式細胞技術(shù)對外周血中CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞表面的HLA-Ⅰ(MHC-Ⅰ)分子進行檢測。采用實時熒光定量PCR技術(shù)對外周血淋巴細胞HLA-ⅠmRNA進行檢測。比較穩(wěn)定組和排斥組的差異，初步從臨床角度評價HLA-Ⅰ對于急性移植排斥反應(yīng)的診斷價值。
　　 結(jié)果:
　　 1.移植皮片的肉眼

15、及病理組織學(xué)結(jié)果95％小鼠在實驗過程中都有體重增長，其余5％在實驗中被排除。同系移植組小鼠皮膚移植物生長良好，移植物縫合部位逐漸愈合，皮片柔軟紅潤。在異系未用藥組和異系用藥組，移植物逐漸變暗、變黑，80％移植物壞死時發(fā)生在術(shù)后第10天和第22天。移植皮片經(jīng)H-E染色，按照淋巴細胞浸潤和皮膚組織壞死程度將急性排斥反應(yīng)分為輕度(Ⅰ級)、中度(Ⅱ級)、重度(Ⅲ級)和極重度(Ⅳ級)四個等級。結(jié)果顯示：隨術(shù)后時間的延長，異系移植皮片淋巴細胞浸潤逐

16、漸增強。不用藥情況下，病理Ⅰ-Ⅳ級排斥反應(yīng)分別發(fā)生于術(shù)后2-4天、4-8天、8-12天和12-16天。用藥情況下，淋巴細胞浸潤時間延遲，病理排斥Ⅰ-Ⅳ級分別發(fā)生于2-8天、8-14天、14-20天、20-26天。同系移植皮片中很少淋巴細胞浸潤，移植病理分級為0或Ⅰ級。
　　 2.未用藥情況下，移植術(shù)后MHC-Ⅰ的表達變化同系移植組，術(shù)后各時間點外周血、皮膚移植物MHC-Ⅰ的表達變化不明顯，與術(shù)前基本保持一致，而異系移植組在術(shù)后各

17、時間點呈現(xiàn)出不同的變化。
　　 外周血淋巴細胞MHC-Ⅰ的表達情況：CD3+-CD84+細胞MHC-Ⅰ膜蛋白在術(shù)后6天表達明顯升高，表達強度約為術(shù)前的1.3倍(MFI從術(shù)前219升高到290)，升高一直持續(xù)到術(shù)后12天，術(shù)后14天MHC-Ⅰ膜蛋白表達回復(fù)到術(shù)前水平，升高的時段與病理Ⅱ-Ⅲ級對應(yīng)：CD3+CD4+細胞MHC-Ⅰ膜蛋白升高開始的時間比CD3+CD8+細胞早2天，但其表達趨勢和表達強度與CD3+CD8+細胞基本一致；實

18、時熒光定量RT-PCR檢測MHC-ⅠmRNA表達與流式細胞術(shù)檢測CD4+細胞MHC-Ⅰ膜蛋白表達規(guī)律一致。異系移植術(shù)后4天，外周血淋巴細胞MHC-Ⅰ表達明顯升高，術(shù)后6天達峰值，約為術(shù)前的4倍(從術(shù)前1.38升高到5.96)，表達升高一直持續(xù)到術(shù)后12天，術(shù)后14天恢復(fù)到術(shù)前水平。
　　 免疫組化檢測結(jié)果：所有小鼠移植皮片組織細胞、血管內(nèi)皮細胞及浸潤淋巴細胞均呈陽性表達，但當(dāng)排斥反應(yīng)發(fā)生時，移植物MHC-Ⅰ表達明顯增強。

19、　　 3.應(yīng)用免疫抑制劑情況下，移植術(shù)前及術(shù)后MHC-Ⅰ的表達變化在移植手術(shù)前，與未用藥相比，用藥后MHC-Ⅰ mRNA及蛋白表達水平降低，說明免疫抑制劑對MHC-Ⅰ的表達有抑制作用。同系移植組，術(shù)后各時間點外周血、皮膚移植物MHC-Ⅰ的表達變化不明顯，與術(shù)前基本保持一致。而異系移植組在術(shù)后各時間點呈現(xiàn)出不同的變化。
　　 外周血淋巴細胞MHC-Ⅰ的表達情況：CD3+CD8+細胞MHC-Ⅰ膜蛋白在術(shù)后12天表達明顯升高，術(shù)后1

20、6天達峰值，表達強度約為術(shù)前的1.3倍(MFI從術(shù)前169升高到228)，升高一直持續(xù)到術(shù)后22天，術(shù)后24天MHC-Ⅰ膜蛋白表達回復(fù)到術(shù)前水平，升高的時段與病理Ⅱ-Ⅲ級對應(yīng)；MHC-Ⅰ膜蛋白在CD3+CD4+T細胞和CD3+CD8+T細胞上表達趨勢和表達強度基本一致，CD3+CD4+細胞MHC-Ⅰ升高開始的時間比CD3+CD8+細胞早4天；實時熒光定量RT-PCR檢測mRNA表達與流式細胞術(shù)檢測CD3+CD4+細胞膜蛋白表達趨勢一致。

21、異系移植術(shù)后8天，外周血淋巴細胞MHC-Ⅰ表達開始升高，術(shù)后16天達峰值，相對表達量約為術(shù)前的9倍(從術(shù)前0.58上升為5.76)，然后逐漸下降到術(shù)后24天恢復(fù)到術(shù)前水平。
　　 免疫組化檢測結(jié)果：所有小鼠皮片組織細胞、血管內(nèi)皮細胞及浸潤淋巴細胞均呈陽性表達，與未用藥組比較，表達強度減弱。但當(dāng)急性排斥反應(yīng)發(fā)生時，移植物MHC-Ⅰ表達增強。
　　 4.感染組小鼠外周血淋巴細胞MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的表達變化與正常對照組相比

22、，感染組小鼠在腹腔注射腸球菌8小時時，外周血白細胞總數(shù)升高，外周血淋巴細胞MHC-Ⅱ mRNA和蛋白表達增強，但外周血淋巴細胞MHC-Ⅰ無論在mRNA水平還是蛋白水平的表達都沒有明顯的變化，說明感染性疾病不影響MHC-Ⅰ的表達。
　　 5.外周血淋巴細胞MHC-Ⅰ與MHC-Ⅱ在急性移植排斥反應(yīng)過程中表達變化的比較外周血淋巴細胞MHC-Ⅱ mRNA表達：在同系移植組，術(shù)后各時間點MHC-Ⅱ表達與術(shù)前相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在未用藥

23、組，MHC-Ⅱ在術(shù)后4天開始升高，術(shù)后6天達峰值，約為術(shù)前的2.1倍(從術(shù)前1.29升高到2.71)，術(shù)后14天降到術(shù)前水平。應(yīng)用免疫抑制劑的情況下，MHC-Ⅱ在術(shù)后8天開始升高，術(shù)后24天恢復(fù)術(shù)前水平。與MHC-Ⅰ表達相比，MHC-Ⅱ升高幅度較小。外周血淋巴細胞MHC-Ⅱ膜蛋白的表達：在未用藥組，僅在術(shù)后6天和8天時升高，在用藥組，僅在術(shù)后12、14、16天表達升高，與MHC-Ⅰ相比，升高開始時間晚、升高持續(xù)時間短。
　　 6

24、.腎移植患者術(shù)前、術(shù)后以及發(fā)生移植排斥時MHC-Ⅰ表達變化穩(wěn)定組：
　　 CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞HLA-Ⅰ膜蛋白表達趨勢相同。術(shù)后一周內(nèi)淋巴細胞HLA-Ⅰ表達稍有升高，升高幅度較小，約為術(shù)前的1.3倍，到術(shù)后2周時，恢復(fù)到術(shù)前水平。外周血淋巴細胞MHC-Ⅰ轉(zhuǎn)錄水平與膜蛋白水平趨勢相同，但變化幅度較小。
　　 排斥組：與排斥前最后一次隨訪檢測的HLA-Ⅰ表達水平相比，在排斥發(fā)生的當(dāng)天，HLA-Ⅰ表達明顯升高

25、(排斥當(dāng)天308.2 vs.術(shù)前110.9)，約為術(shù)前的2.7倍。應(yīng)用免疫抑制劑沖擊治療3天后，HLA-Ⅰ表達明顯下降，7天后，HLA-Ⅰ表達逐漸降低到術(shù)前水平。
　　 反復(fù)發(fā)生排斥反應(yīng)的患者HLA-Ⅰ始終處于高表達水平，免疫抑制劑沖擊治療對HLA-Ⅰ的表達影響較小。
　　 結(jié)論:
　　 1.動物實驗研究發(fā)現(xiàn)在急性移植排斥的早期階段，病理顯示Ⅱ-Ⅲ級時，外周血淋巴細胞MHC-Ⅰ蛋白和mRNA水平表達升高。與MHC