SLP1在結腸癌中的表達及其腫瘤生物學功能的初步研究.pdf

1、目的：目前雖然對于腫瘤的發(fā)病機理和腫瘤基因靶向治療方面已經(jīng)取得了巨大的進展，但是，腫瘤仍然是危害人類健康的一個重大問題。由于近年來WHO提倡開展腫瘤的早期預防、早期診斷以及早期治療，結直腸癌(Colorectal cancer，CRC)的發(fā)病率和死亡率開始呈現(xiàn)逐年下降的趨勢，盡管如此，每年全球有超過100萬的新發(fā)病例，其中有近一半的病例發(fā)生死亡，并且結直腸癌仍然是引起腫瘤相關性死亡的第三大病因。在我國，CRC發(fā)病的一個主要特點是40歲以

2、上的男性為高發(fā)人群，而且近年來還呈現(xiàn)低齡化的趨勢。在結直腸的治療方面，常規(guī)結腸手術根治切除以及不斷更新發(fā)展的輔助性放化療(chemo-radiotherapy,CRT)雖然可以提高患者的生存率，但是結直腸癌復發(fā)和轉移仍然是導致腫瘤相關性死亡的重要原因之一，已經(jīng)嚴重威脅我國人民的身心健康。盡管眾多專家學者對結直腸癌發(fā)生、發(fā)展以及轉移機制等方面進行了大量基礎與臨床研究，但是其詳細作用機制尚未完全明確。因此，從基因水平和蛋白水平，以及分子生物

3、學水平上探索CRC細胞增殖和侵襲能力以及腫瘤細胞生長調控相關機制的研究，對于CRC的早期預防、早期診斷和提高生存率具有重要意義。RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術是Fire等學者于1998年在對秀麗新小桿線蟲的基因組研究計劃時發(fā)現(xiàn)的，并首先闡述dsRNA能選擇性及特異性地抑制目的基因的表達，而命名為RNAi技術。此后，RNAi技術便在全球范圍內廣泛的開展和應用，研究人員發(fā)現(xiàn)無論在真核生物還是哺乳動物細胞中均存在

4、RNAi干擾現(xiàn)象。RNAi是近年來用于基因研究的一項新技術，在研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉移過程中，RNAi可用于研究任何有異常高表達的基因的功能。RNAi是一種由雙鏈RNA序列引起的特異性轉錄后基因沉默過程，它能導致特定目的基因沉默，并提供了強大的反向遺傳學的方法來分析基因在體外和體內的功能。目前在實驗研究中，使用最廣泛的核酸序列特異性基因沉默分子是一種小分子干擾RNA(Small interfering RNA，siRNA)，被稱為siR

5、NA，它呈對稱結構的，通常是由21-23個堿基對組成。此方法能夠特異地，有效地抑制目標基因的表達。基因治療(gene therapy)是將功能基因轉移至患者體內糾正有缺陷的基因，使患者重新恢復基因原來功能，以達到臨床治療的目的。RNAi技術是由雙鏈RNA啟動序列特異性的基因沉默，通過細胞轉染技術，可使導入DNA序列干擾癌基因表達和恢復抑癌基因功能。RNAi有以下作用特點:首先，具有高度的特異性。根據(jù)堿基互補配對原則，siRNA和具有同源

6、序列的目的mRNA發(fā)生特異性結合，導致同源mRNA的降解，使同源基因的表達沉默，而其他非同源基因的表達則不會發(fā)生變化，因此利用這一特征可以針對一些疾病開展基因治療。其次，具有高效性。用很少量的dsRNA便可以將濃度是幾倍甚至是十幾倍的mRNA發(fā)生抑制降解。這是因為，首先當mRNA出現(xiàn)降解時，siRNA可連續(xù)地發(fā)揮降解作用;其次與RNA依賴性RNA多聚酶的作用有關，即在RNA依賴性RNA多聚酶的作用下，dsRNA開始復制，最終是產(chǎn)生大量的

7、dsRNA導致mRNA降解。再者，具有高度的穩(wěn)定性。siRNA分子具有非常穩(wěn)定的化學結構，特別是3'端懸垂TT堿基的dsRNA。它不同于反義核酸技術，無需進行廣泛的化學修飾。對于shRNA來說，由于loop環(huán)結構的插入，大大的提高了shRNA的高效性和穩(wěn)定性。目前RNAi技術已經(jīng)廣泛應用于基因功能鑒定，基因表達、以及轉錄后調控等熱門領域的研究中，可以為多種疾病開展基因治療提供新的思路。本項實驗即應用RNAi技術來沉默SLPI基因在結腸癌

8、細胞的表達，來研究對體外培養(yǎng)的結腸癌Lovo細胞生物學形態(tài)及功能的影響。分泌性白細胞蛋白酶抑制劑（secretory leukocyte peptidase inhibitor, SLPI）是絲氨酸蛋白酶抑制因子，屬于WAP家族，既是炎癥抑制因子又是蛋白酶抑制劑，具有調控細胞分化增殖的能力，可能具有抑制腫瘤發(fā)生及轉移作用。目前國內外文獻報道SLPI與腫瘤密切相關，但它在不同腫瘤中的表達水平不同。有學者研究發(fā)現(xiàn)，SLPI蛋白及mRNA在胃

9、癌患者表達升高，并且表達量與腫瘤分期密切相關，晚期胃癌明顯高于早期胃癌，有漿膜浸潤者明顯高于無漿膜浸潤者。而在前列腺癌組織中，與正常前列腺組織相比SLPI表達是下調的，因此推測SLPI可能作為抑癌基因在前列腺腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中起作用，可能推測SLPI在不同腫瘤組織中作用的機制不同，導致蛋白的表達水平不一。目前尚沒有關于SLPI基因與結腸癌研究方面的相關報道。我們首先運用組織芯片技術，回顧性分析廈門市第二醫(yī)院普通外科2008年1月至201

10、2年12月行手術切除的150例結腸癌組織及癌旁正常組織標本，應用免疫組織化學方法探討結腸癌組織中SLPI蛋白的表達是否與腫瘤細胞的分化程度、腫瘤臨床TNM分期以及有無淋巴結轉移等臨床病理因素存在相關性。然后，應用RNAi技術抑制SLPI蛋白及SLPImRNA在結腸癌Lovo細胞中的表達，觀察對腫瘤細胞生物學功能的影響，為揭示SLPI在結腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用提供依據(jù)，同時為結腸癌的治療及早期診斷研究開辟新的思路。
　　 方法：⑴

11、回顧分析在廈門市第二醫(yī)院普通外科2008年1月至2012年12月行手術切除的150例結腸癌組織及癌旁正常組織標本，用10％甲醛固定后石蠟包埋存檔，所有標本均詳細記載病人基本信息，記錄腫瘤TNM分期，分化程度，淋巴結轉移和遠處轉移情況。采用免疫組織化學SP法檢測SLPI蛋白在不同組織標本間表達水平的差異，一抗采用鼠抗人SLPI單克隆抗體，抗體購于美國Santa Cluz公司，實驗步驟按試劑盒說明書進行。結果判斷標準如下:陰性為無色，陽性為

12、細胞質染色呈棕黃色。根據(jù)陽性染色細胞所占的百分數(shù)計分:在高倍視野下每張切片選擇10個有代表性的視野，每個視野計數(shù)一百個腫瘤細胞，共計數(shù)一千個細胞。將陽性細胞數(shù)小于或等于5％計為0分;陽性細胞數(shù)10％-25％計為1分;陽性細胞數(shù)25％-50％計為2分;陽性細胞數(shù)大于50％計為3分;將0-2分計為低表達;3分計為高表達。采用免疫組織化學SP方法檢測SLPI在結腸癌組織中的表達水平與患者性別、年齡、分化程度，TNM分期以及淋巴結轉移、遠處轉移

13、等臨床病理因素之間的關系。⑵應用RNAi技術沉默SLPI基因，分別應用qRT-PCR和Western blot檢測siRNA對SLPImRNA及SLPI蛋白的沉默水平;MTT方法檢測SLPI蛋白沉默對結腸癌Lovo細胞增殖能力的影響;細胞粘附實驗檢測SLPI蛋白沉默對細胞粘附能力的影響;細胞劃痕試驗和Transwell實驗評價SLPI蛋白沉默對結腸癌Lovo細胞的遷移能力的影響。⑶采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料的比

14、較采用下x2檢驗，對單元格的期望頻數(shù)均大于1，但有小于1/5的單元格期望頻數(shù)小于5，采用連續(xù)性校正x2檢驗。細胞粘附能力、遷移能力、增殖實驗的比較采用小樣本student t檢驗，以α=0.05為檢驗水準，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：①應用免疫組織化學的方法對SLPI蛋白在結腸癌中的表達情況進行分析，SLPI蛋白在癌旁正常組織中不表達，而在腫瘤組織中，SLPI陽性表達在細胞漿。分析SLPI蛋白的表達與患者的臨床特征

15、之間的關系，如表1-1，結果發(fā)現(xiàn)SLPI蛋白的陽性表達與腫瘤分化程度呈正相關(P＜0.05)，在低分化腫瘤，SLPI的陽性表達率高，細胞染色深。此外，SLPI蛋白的表達強度與有無淋巴結轉移呈現(xiàn)顯著的相關性，有淋巴結轉移的患者SLPI陽性表達率高于無轉移者(P＜0.05)。SLPI與腫瘤的TNM分期具有顯著的相關，其中Ⅲ期和Ⅳ期患者中的SLPI的陽性表達率明顯比Ⅰ期和Ⅱ期患者高(P＜0.05);而且，在是否有遠處轉移方面，合并遠處轉移患者

16、SLPI蛋白的表達比無遠處轉移患者的表達水平高(P＜0.05)。此外，SLPI的表達與患者年齡及性別無關。②實驗研究通過應用RNAi技術使SLPI基因沉默，并探討其在結腸癌Lovo細胞中的生物學作用。對于結腸癌Lovo細胞來說，合適的siRNA轉染試劑比例為SiRNA75ng、轉染試劑1.5ul，轉染72小時后Hs-SLPI-5 siRNA沉默SLPI的效果比Hs-SLPI-6 siRNA能夠沉默SLPI的效果稍好，因此選擇Hs_ SL

17、PI_5 siRNA作為干預基因用于開展相關實驗研究。沉默SLPI基因的結果導致了，細胞的增殖能力下降，粘附性能增強，遷移能力降低，表明SLPI在結腸癌細胞的粘附及遷移中可能發(fā)揮重要作用。結合第一部分實驗結果所示，SLPI蛋白在結腸癌組織中的表達水平比癌旁組織表達明顯升高，高于癌旁組織的結果提示SLPI在細胞的侵襲和轉移中的過程中可能起重要的作用，然而，其中所涉及的詳細的機制還有待于開展進一步的研究。
　　 結論：⑴SLPI蛋白

18、陽性反應產(chǎn)物主要定位在細胞漿，在正常結腸黏膜組織中未表達，但在結腸癌組織中均有表達，其高表達與腫瘤的低分化、Ⅲ-Ⅳ期，結腸癌局部淋巴結轉移及遠處轉移有相關性，SLPI的表達強度隨分化程度的降低而增加。Ⅲ-Ⅳ期腫瘤的SLPI蛋白的表達水平明顯高于Ⅰ-Ⅱ期，SLPI在有淋巴結轉移患者的表達水平要明顯高于無淋巴結患者的水平，有遠處轉移患者的SLPI蛋白的表達水平要明顯高于無遠處轉移的患者。SLPI在結腸癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，有可能