檢測斑疹傷寒病原體實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立黑龍江立克次體和立克次體精河株毒力和抗原性初步研究.pdf

1、第一部分檢測斑疹傷寒病原體的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法建立 斑疹傷寒病原體包括普氏立克次體和莫氏立克次體，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR TaqM MGB探針技術(shù)，根據(jù)兩者的外膜蛋白B基因序列(ompB)分別設(shè)計(jì)一對種特異性引物與一個(gè)種特異性探針，建立了檢測斑疹傷寒病原體——普氏立克次體、莫氏立克次體的兩種實(shí)時(shí)熒光定量PCR。 用這兩種熒光定量PCR分別檢測兩種斑疹傷寒病原體的標(biāo)準(zhǔn)目的DNA，最低檢出量小于10個(gè)拷貝，檢出靈敏

2、度約為普通PCR的1000倍；用兩種方法分別檢測其它立克次體和相關(guān)的病原菌DNA樣本，檢出結(jié)果均為陰性。 用這兩種定量PCR方法分別檢測普氏立克次體和莫氏立克次體感染豚鼠血樣本，從感染第3天到第18天的大部分血樣本檢測為陽性，而用相應(yīng)的普通PCR檢測血樣本，結(jié)果均為陰性。用一種定量PCR方法檢測另一種定量PCR方法檢出的陽性樣本，檢測結(jié)果均為陰性。 本研究建立的檢測兩種斑疹傷寒病原體的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法具有高度種特異

3、性和敏感性，適合于快速檢測斑疹傷寒感染早期血樣本中微量立克次體DNA，快速確診流行性斑疹傷寒和地方性斑疹傷寒。 第二部分黑龍江立克次體和立克次體精河株的毒力與抗原性初步研究 斑點(diǎn)熱(spotted fever)是由斑點(diǎn)熱群立克次體(spotted fever group rickettsiae，SFGR)所引起的一組疾病的總稱。本研究采用斑點(diǎn)熱群特異性實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以經(jīng)典的斑點(diǎn)熱病原體——立氏立克次體R株為參照，對

4、我國分離的黑龍江立克次體和立克次體精河株的毒力和抗原性進(jìn)行了初步的比較研究。 黑龍江立克次體和立克次體精河株與立氏立克次體一樣可生長、繁殖在Vero細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，電鏡觀察顯示兩者的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與立氏立克次體非常相似。 用相同濃度的立克次體細(xì)胞培養(yǎng)物分別感染小鼠和豚鼠，在感染后2-3天豚鼠的體溫開始升高，在7天左右豚鼠的發(fā)熱達(dá)高峰，體溫測量結(jié)果顯示立氏立克次體感染豚鼠發(fā)熱的體溫峰值和15天平均體溫最高，立克次體精河株感染豚鼠次

5、之，黑龍江立克次體最低。 用熒光定量PCR的方法檢測立克次體感染小鼠臟器標(biāo)本，檢測結(jié)果顯示立氏立克次體在小鼠肝、脾中的繁殖量顯著高于立克次體精河株和黑龍江立克次體，顯示立氏立克次體的高毒力。但是在感染早期，立克次體精河株在小鼠肺部的繁殖量卻顯著高于立氏立克次體，其嗜肺細(xì)胞的特性值得注意。 用間接免疫熒光法檢測3種立克次體感染血清和作它們的血清交叉反應(yīng)，結(jié)果顯示交叉反應(yīng)特異性抗體滴度比同源反應(yīng)特異性抗體滴度低4倍以上，提示