鼻咽癌細(xì)胞株可能相關(guān)瘤基因-抑瘤基因的初步篩選和PTHLH的過表達(dá)研究.pdf

1、鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一種上皮源性惡性腫瘤,絕大多數(shù)屬于低分化鱗狀細(xì)胞癌,惡性程度高,早期易發(fā)生淋巴結(jié)和全身遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,具有相當(dāng)高的死亡率。鼻咽癌的地區(qū)分布極不均衡,在我國南方及東南亞一帶發(fā)病率較高,其中又以廣東省的發(fā)病率最高,故有“廣東瘤”之稱。目前認(rèn)為遺傳因素、EBV(Epstein-Barr Virus)感染、遺傳易感性、飲食和某些環(huán)境化學(xué)促癌物和/或致癌物因素與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)

2、,在這些因素的共同作用下,正常鼻咽上皮細(xì)胞發(fā)生遺傳和表觀遺傳學(xué)改變不斷積累,最終引起細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致鼻咽癌的發(fā)生。但NPC的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。
　　 腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素參與、多基因改變、多步驟演進(jìn)的復(fù)雜過程,受到體內(nèi)、外各種因素的作用和影響,是許多腫瘤瘤基因激活或腫瘤抑制基因失活所致。瘤基因是由于存在正常細(xì)胞中的原瘤基因在某些致瘤因素作用下激活而成,瘤基因的活化是人類腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素,瘤基因數(shù)量的增加或表達(dá)活性

3、的增加或突變,均會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。抑瘤基因是作用細(xì)胞增殖和分化的重要調(diào)控因子,在正常細(xì)胞中起阻滯細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞分化的功能。抑瘤基因的缺失或突變失活可使瘤基因充分發(fā)揮作用也會(huì)導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展,瘤基因和抑瘤基因同樣起關(guān)鍵作用。迄今為止,鼻咽癌抑瘤基因的研究,已有重大進(jìn)展,RASSF1A、BLU、BRD7、DAPK1、DLC1等多個(gè)基因已在基因表達(dá)變化沉默后對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響等方面被證實(shí)具有鼻咽癌抑瘤基因的潛

4、質(zhì),而且發(fā)現(xiàn)其分子機(jī)制主要為基因的甲基化。但鼻咽癌瘤基因的研究則相對滯后,雖然已有BCL2、CCND1、EGFR、TP73L、EVI1、HRAS、NRAS、STAT2、INT2、FGF3、MDM2、MYC、PIK3CA等基因由于在鼻咽癌中的擴(kuò)增或過表達(dá)而被推測為鼻咽癌潛在的瘤基因,但鮮有報(bào)道過表達(dá)后對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,更沒有體內(nèi)報(bào)道。因此,探索鼻咽癌瘤基因及其作用機(jī)制對于揭示鼻咽癌的發(fā)病機(jī)理就顯得尤為重要。
　　 本實(shí)驗(yàn)組前

5、期通過收集五個(gè)實(shí)驗(yàn)室發(fā)表的170例鼻咽癌比較基因組雜交(CGH)數(shù)據(jù)構(gòu)建鼻咽癌發(fā)病機(jī)制的樹模型。研究結(jié)果提示了11個(gè)鼻咽癌的重要染色體變異事件,其中12p12-11區(qū)域的擴(kuò)增是鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的早期事件,但是該區(qū)域仍然含有上百個(gè)基因。2005年Garraway等人結(jié)合SNP芯片和表達(dá)譜芯片分析發(fā)現(xiàn)黑色素瘤瘤基因MITF。我們先前采用同樣的辦法,整合分析本實(shí)驗(yàn)室已有的五種鼻咽癌細(xì)胞(CNE1,CNE2,HONE1,5-8F 6-10B)和N

6、P69的SNP芯片數(shù)據(jù)和三種鼻咽癌細(xì)胞(CNE1,CNE2,HONE1)和NP69的表達(dá)芯片數(shù)據(jù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)了12p12-11區(qū)域既擴(kuò)增又過表達(dá)基因PTHLH。PTHLH是甲狀旁腺激素受體家族成員,在惡性腫瘤的體液性高鈣血癥、乳腺癌和前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用,能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、浸潤、遷移及成瘤能力。因此,我們推測PTHLH基因可能在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用。
　　 基于前面工作的基礎(chǔ)上,本課題的研究目的為采用整合分析方法

7、,篩選鼻咽癌細(xì)胞株CNE1、CNE2、HONE1基因組中的可能相關(guān)的瘤基因及抑瘤基因,對其進(jìn)行初步的生物信息學(xué)研究。接著改變作為候選靶基因之一PTHLH的表達(dá)水平,觀察其對鼻咽癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響及可能的作用機(jī)制,為深入理解鼻咽癌發(fā)病的分子機(jī)制和尋找新的分子靶向治療靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ),為此本課題進(jìn)行了如下研究:
　　 (一)瘤基因及抑瘤基因篩選及初步生物信息學(xué)分析
　　 通過Ensembl database整合鼻咽癌細(xì)

8、胞株SNP芯片數(shù)據(jù)、表達(dá)譜數(shù)據(jù)及已知正?？截悢?shù)變化CNVs數(shù)據(jù),篩選鼻咽癌細(xì)胞中可能相關(guān)的瘤基因及抑瘤基因。得到160個(gè)可能相關(guān)的靶基因,其中既擴(kuò)增又過表達(dá)為102個(gè),既缺失又低表達(dá)為58個(gè)。從160個(gè)基因當(dāng)中隨機(jī)抽取9個(gè)基因進(jìn)行表達(dá)水平的檢驗(yàn),結(jié)果示除ILK外都與芯片結(jié)果一致,因此芯片結(jié)果可靠。PANTHER軟件分析顯示這160基因的功能包括:轉(zhuǎn)錄因子,核酸及脫氧核酸結(jié)合因子,膜運(yùn)輸?shù)鞍准罢{(diào)節(jié)蛋白,各種生物酶和激酶等,參與的通路主要包

9、括P53通路、細(xì)胞周期、凋亡通路等。由于這些生物學(xué)功能涉及到了腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的多個(gè)階段,因而瘤基因/抑瘤基因在鼻咽癌中的表達(dá)失調(diào),可能通過調(diào)控下游一系列靶基因的表達(dá)進(jìn)而引起鼻咽癌細(xì)胞多方面生物學(xué)特性的改變。
　　 隨后我們利用GenCLiP軟件分別對三組基因(102可能相關(guān)的瘤基因、58可能相關(guān)的抑瘤基因和160二者混合基因)進(jìn)行聚類分析和構(gòu)建基因網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果三組基因都與瘤/抑瘤基因、EMT、鼻咽癌、EBV存在著密切關(guān)系。

10、我們對其中與“瘤/抑瘤基因”的相關(guān)性進(jìn)行10,000次的隨機(jī)模擬,結(jié)果三組基因的P值分別為0.008、0.044和0.006,證明我們篩選的基因確實(shí)為鼻咽癌的可能相關(guān)的瘤/抑瘤基因。GenCLiP還預(yù)測PTHLH可能通過CDK2影響鼻咽癌的異常生長。
　　 (二)過表達(dá)PTHLH對鼻咽癌的影響
　　 我們前期已證明PTHLH是鼻咽癌細(xì)胞株染色體12p12-11中唯一既擴(kuò)增又過表達(dá)的候選靶基因。因此,本研究在鼻咽癌細(xì)胞株中

11、過表達(dá)PTHLH,觀察其對鼻咽癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響,并預(yù)測可能與其共同作用的候選靶基因。
　　 采用熒光定量RT-PCR.檢測5-8F、6-10B、CNE1、CNE2和HONE1等5種鼻咽癌細(xì)胞株和永生化鼻咽上皮細(xì)胞株NP69中PTHLH的表達(dá)情況,結(jié)果顯示6種細(xì)胞株中PTHLH的表達(dá)差異具有顯著性(F=100.473,P=0.000)。運(yùn)用2-△Ct法對6種鼻咽癌細(xì)胞株中PTHLH的表達(dá)水平與NP69相比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTH

12、LH在5-8F、CNE1、CNE2和HONE1中的表達(dá)水平均高于NP69,而在CNE1中的表達(dá)水平最低。因此選CNEl作為過表達(dá)細(xì)胞珠。
　　 通過克隆重組PTHLH,構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體pGC-FLI/PTHLH,病毒包裝后感染CNE1細(xì)胞,然后六孔板分選鑒定GFP+細(xì)胞,建立了穩(wěn)定過表達(dá)PTHLH的鼻咽癌細(xì)胞株CNE1pGC-FU/PTHLH.
　　 采用MTT 法檢測PTHLH過表達(dá)后細(xì)胞的體外增殖情況,結(jié)果顯示與C

13、NE1pGC-FU和CNE1細(xì)胞相比,CNE1pGC-FU/PTHLH細(xì)胞的增殖速度顯著增快,并且呈時(shí)間依賴關(guān)系(F=1208.48,P=0.000)。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果同樣顯示四組細(xì)胞的增殖能力具有顯著性差異(F=43.771,P=0.000)。流式細(xì)胞儀檢測四組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布,結(jié)果顯示與CNE1pGC-FU和CNE1細(xì)胞相比,CNE1pGC-FU/PTHLH細(xì)胞周期G1期、S期存在顯著性差異(F=12.722,P=0.002

14、)(F=42.888,P=0.000)。綜上所述,PTHLH的過表達(dá)顯著促進(jìn)了鼻咽癌細(xì)胞的體外增殖能力。
　　 采用Transwell小室檢測PTHLH過表達(dá)后細(xì)胞體外遷移運(yùn)動(dòng)能力的改變,結(jié)果顯示與CNE1pGC-FU和CNE1細(xì)胞相比,CNE1pGC-FU/PTHLH細(xì)胞穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)增多,差異具有顯著性(F=316.382,P=0.000)。劃痕實(shí)驗(yàn)亦出現(xiàn)如上所訴結(jié)果。結(jié)果表明PTHLH過表達(dá)后顯著增強(qiáng)了鼻咽癌細(xì)胞的

15、體外遷移。
　　 對預(yù)測的可能與PTHLH存在于同一信號通路的基因CDK2,利用熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示與CNE1pGC-FU和CNE1細(xì)胞相比,CNE1pGC-FU/PTHLH細(xì)胞CDK2的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.527,P=0.024)。表明過表達(dá)PTHLH影響CDK2的表達(dá)水平。在鼻咽癌中,二者通過何機(jī)制、通路發(fā)揮作用,善進(jìn)一步研究。
　　 結(jié)論
　　 1)通過整合分析鼻咽癌細(xì)胞株CNE1、

16、CNE2和HONE1以及永生化鼻咽上皮細(xì)胞株NP69的SNP芯片和表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù),篩選出160個(gè)可能相關(guān)的瘤基因及抑瘤基因,其中既擴(kuò)增又過表達(dá)的瘤基因102個(gè),既丟失又低表達(dá)的抑瘤基因58個(gè)。
　　 2)這160個(gè)可能相關(guān)的靶基因與EBV和EMT等密切相關(guān),發(fā)揮多種生物學(xué)功能,可能參與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段。
　　 3)可能相關(guān)的瘤基因PTHLH過表達(dá)后顯著促進(jìn)了鼻咽癌細(xì)胞的體外增殖等能力,可能與CDK2等候選靶基因共