鼻咽癌細胞株可能相關(guān)瘤基因-抑瘤基因的初步篩選和PTHLH的過表達研究.pdf

1、鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一種上皮源性惡性腫瘤,絕大多數(shù)屬于低分化鱗狀細胞癌,惡性程度高,早期易發(fā)生淋巴結(jié)和全身遠處轉(zhuǎn)移,具有相當高的死亡率。鼻咽癌的地區(qū)分布極不均衡,在我國南方及東南亞一帶發(fā)病率較高,其中又以廣東省的發(fā)病率最高,故有“廣東瘤”之稱。目前認為遺傳因素、EBV(Epstein-Barr Virus)感染、遺傳易感性、飲食和某些環(huán)境化學促癌物和/或致癌物因素與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)

2、,在這些因素的共同作用下,正常鼻咽上皮細胞發(fā)生遺傳和表觀遺傳學改變不斷積累,最終引起細胞的惡性轉(zhuǎn)化,導致鼻咽癌的發(fā)生。但NPC的發(fā)病機制尚不清楚。
　　 腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多因素參與、多基因改變、多步驟演進的復雜過程,受到體內(nèi)、外各種因素的作用和影響,是許多腫瘤瘤基因激活或腫瘤抑制基因失活所致。瘤基因是由于存在正常細胞中的原瘤基因在某些致瘤因素作用下激活而成,瘤基因的活化是人類腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素,瘤基因數(shù)量的增加或表達活性

3、的增加或突變,均會導致腫瘤的發(fā)生。抑瘤基因是作用細胞增殖和分化的重要調(diào)控因子,在正常細胞中起阻滯細胞增殖,促進細胞分化的功能。抑瘤基因的缺失或突變失活可使瘤基因充分發(fā)揮作用也會導致惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展,瘤基因和抑瘤基因同樣起關(guān)鍵作用。迄今為止,鼻咽癌抑瘤基因的研究,已有重大進展,RASSF1A、BLU、BRD7、DAPK1、DLC1等多個基因已在基因表達變化沉默后對細胞生物學行為的影響等方面被證實具有鼻咽癌抑瘤基因的潛

4、質(zhì),而且發(fā)現(xiàn)其分子機制主要為基因的甲基化。但鼻咽癌瘤基因的研究則相對滯后,雖然已有BCL2、CCND1、EGFR、TP73L、EVI1、HRAS、NRAS、STAT2、INT2、FGF3、MDM2、MYC、PIK3CA等基因由于在鼻咽癌中的擴增或過表達而被推測為鼻咽癌潛在的瘤基因,但鮮有報道過表達后對細胞生物學行為的影響,更沒有體內(nèi)報道。因此,探索鼻咽癌瘤基因及其作用機制對于揭示鼻咽癌的發(fā)病機理就顯得尤為重要。
　　 本實驗組前

5、期通過收集五個實驗室發(fā)表的170例鼻咽癌比較基因組雜交(CGH)數(shù)據(jù)構(gòu)建鼻咽癌發(fā)病機制的樹模型。研究結(jié)果提示了11個鼻咽癌的重要染色體變異事件,其中12p12-11區(qū)域的擴增是鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的早期事件,但是該區(qū)域仍然含有上百個基因。2005年Garraway等人結(jié)合SNP芯片和表達譜芯片分析發(fā)現(xiàn)黑色素瘤瘤基因MITF。我們先前采用同樣的辦法,整合分析本實驗室已有的五種鼻咽癌細胞(CNE1,CNE2,HONE1,5-8F 6-10B)和N

6、P69的SNP芯片數(shù)據(jù)和三種鼻咽癌細胞(CNE1,CNE2,HONE1)和NP69的表達芯片數(shù)據(jù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)了12p12-11區(qū)域既擴增又過表達基因PTHLH。PTHLH是甲狀旁腺激素受體家族成員,在惡性腫瘤的體液性高鈣血癥、乳腺癌和前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用,能促進結(jié)腸癌細胞的增殖、浸潤、遷移及成瘤能力。因此,我們推測PTHLH基因可能在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用。
　　 基于前面工作的基礎(chǔ)上,本課題的研究目的為采用整合分析方法

7、,篩選鼻咽癌細胞株CNE1、CNE2、HONE1基因組中的可能相關(guān)的瘤基因及抑瘤基因,對其進行初步的生物信息學研究。接著改變作為候選靶基因之一PTHLH的表達水平,觀察其對鼻咽癌細胞株生物學行為的影響及可能的作用機制,為深入理解鼻咽癌發(fā)病的分子機制和尋找新的分子靶向治療靶點奠定理論基礎(chǔ),為此本課題進行了如下研究:
　　 (一)瘤基因及抑瘤基因篩選及初步生物信息學分析
　　 通過Ensembl database整合鼻咽癌細

8、胞株SNP芯片數(shù)據(jù)、表達譜數(shù)據(jù)及已知正?？截悢?shù)變化CNVs數(shù)據(jù),篩選鼻咽癌細胞中可能相關(guān)的瘤基因及抑瘤基因。得到160個可能相關(guān)的靶基因,其中既擴增又過表達為102個,既缺失又低表達為58個。從160個基因當中隨機抽取9個基因進行表達水平的檢驗,結(jié)果示除ILK外都與芯片結(jié)果一致,因此芯片結(jié)果可靠。PANTHER軟件分析顯示這160基因的功能包括:轉(zhuǎn)錄因子,核酸及脫氧核酸結(jié)合因子,膜運輸?shù)鞍准罢{(diào)節(jié)蛋白,各種生物酶和激酶等,參與的通路主要包

9、括P53通路、細胞周期、凋亡通路等。由于這些生物學功能涉及到了腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的多個階段,因而瘤基因/抑瘤基因在鼻咽癌中的表達失調(diào),可能通過調(diào)控下游一系列靶基因的表達進而引起鼻咽癌細胞多方面生物學特性的改變。
　　 隨后我們利用GenCLiP軟件分別對三組基因(102可能相關(guān)的瘤基因、58可能相關(guān)的抑瘤基因和160二者混合基因)進行聚類分析和構(gòu)建基因網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果三組基因都與瘤/抑瘤基因、EMT、鼻咽癌、EBV存在著密切關(guān)系。

10、我們對其中與“瘤/抑瘤基因”的相關(guān)性進行10,000次的隨機模擬,結(jié)果三組基因的P值分別為0.008、0.044和0.006,證明我們篩選的基因確實為鼻咽癌的可能相關(guān)的瘤/抑瘤基因。GenCLiP還預測PTHLH可能通過CDK2影響鼻咽癌的異常生長。
　　 (二)過表達PTHLH對鼻咽癌的影響
　　 我們前期已證明PTHLH是鼻咽癌細胞株染色體12p12-11中唯一既擴增又過表達的候選靶基因。因此,本研究在鼻咽癌細胞株中

11、過表達PTHLH,觀察其對鼻咽癌細胞株生物學行為的影響,并預測可能與其共同作用的候選靶基因。
　　 采用熒光定量RT-PCR.檢測5-8F、6-10B、CNE1、CNE2和HONE1等5種鼻咽癌細胞株和永生化鼻咽上皮細胞株NP69中PTHLH的表達情況,結(jié)果顯示6種細胞株中PTHLH的表達差異具有顯著性(F=100.473,P=0.000)。運用2-△Ct法對6種鼻咽癌細胞株中PTHLH的表達水平與NP69相比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTH

12、LH在5-8F、CNE1、CNE2和HONE1中的表達水平均高于NP69,而在CNE1中的表達水平最低。因此選CNEl作為過表達細胞珠。
　　 通過克隆重組PTHLH,構(gòu)建慢病毒表達載體pGC-FLI/PTHLH,病毒包裝后感染CNE1細胞,然后六孔板分選鑒定GFP+細胞,建立了穩(wěn)定過表達PTHLH的鼻咽癌細胞株CNE1pGC-FU/PTHLH.
　　 采用MTT 法檢測PTHLH過表達后細胞的體外增殖情況,結(jié)果顯示與C

13、NE1pGC-FU和CNE1細胞相比,CNE1pGC-FU/PTHLH細胞的增殖速度顯著增快,并且呈時間依賴關(guān)系(F=1208.48,P=0.000)。平板克隆形成實驗的結(jié)果同樣顯示四組細胞的增殖能力具有顯著性差異(F=43.771,P=0.000)。流式細胞儀檢測四組細胞的細胞周期分布,結(jié)果顯示與CNE1pGC-FU和CNE1細胞相比,CNE1pGC-FU/PTHLH細胞周期G1期、S期存在顯著性差異(F=12.722,P=0.002

14、)(F=42.888,P=0.000)。綜上所述,PTHLH的過表達顯著促進了鼻咽癌細胞的體外增殖能力。
　　 采用Transwell小室檢測PTHLH過表達后細胞體外遷移運動能力的改變,結(jié)果顯示與CNE1pGC-FU和CNE1細胞相比,CNE1pGC-FU/PTHLH細胞穿過聚碳酸酯膜的細胞數(shù)增多,差異具有顯著性(F=316.382,P=0.000)。劃痕實驗亦出現(xiàn)如上所訴結(jié)果。結(jié)果表明PTHLH過表達后顯著增強了鼻咽癌細胞的

15、體外遷移。
　　 對預測的可能與PTHLH存在于同一信號通路的基因CDK2,利用熒光定量PCR進行驗證。結(jié)果顯示與CNE1pGC-FU和CNE1細胞相比,CNE1pGC-FU/PTHLH細胞CDK2的表達差異具有統(tǒng)計學意義(F=5.527,P=0.024)。表明過表達PTHLH影響CDK2的表達水平。在鼻咽癌中,二者通過何機制、通路發(fā)揮作用,善進一步研究。
　　 結(jié)論
　　 1)通過整合分析鼻咽癌細胞株CNE1、

16、CNE2和HONE1以及永生化鼻咽上皮細胞株NP69的SNP芯片和表達譜芯片數(shù)據(jù),篩選出160個可能相關(guān)的瘤基因及抑瘤基因,其中既擴增又過表達的瘤基因102個,既丟失又低表達的抑瘤基因58個。
　　 2)這160個可能相關(guān)的靶基因與EBV和EMT等密切相關(guān),發(fā)揮多種生物學功能,可能參與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的各個階段。
　　 3)可能相關(guān)的瘤基因PTHLH過表達后顯著促進了鼻咽癌細胞的體外增殖等能力,可能與CDK2等候選靶基因共