免疫性血小板減少癥遺傳易感性的初步研究.pdf

1、課題一：
　　 第一部分PTPN22基因多態(tài)性與免疫性血小板減少癥遺傳易感性的相關(guān)性研究
　　 研究背景及目的:非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶22(protein tyrosine phosphatase，non-receptor type22，PTPN22)基因編碼產(chǎn)物為淋巴酪氨酸磷酸酶(Lymphoidtyrosine phosphatase, LYP)，該酶能夠?qū)細(xì)胞活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起負(fù)向調(diào)控作用。近年的研究表明PTPN2

2、2多態(tài)性和多種自身免疫性疾病患病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。免疫性血小板減少癥（Immune Thrombocytopenia，ITP）是一種獲得性器官特異性自身免疫性疾病，本研究的目的是探討PTPN22基因多態(tài)性與ITP遺傳易感性的關(guān)系。
　　 研究方法:病例對照研究。采用聚合酶鏈反應(yīng)-基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(PCR-MALDI-TOF MS)對191例ITP患者和216例健康對照PTPN22基因-1123G＞C(rs248845

3、7)位點(diǎn)進(jìn)行基因型鑒定分析。
　　 結(jié)果: PTPN22-1123 G＞C位點(diǎn)優(yōu)勢等位基因?yàn)镃，健康對照人群中C、G等位基因頻率比70.6％;29.4％。ITP組-1123G＞C位點(diǎn)等位基因G及GG基因型頻率分布顯著高于正常對照組(P=0.034;P=0.038);G、GG、GC的優(yōu)勢比(OR)及95％置信區(qū)間(95％CI)分別為1.374（1.024～1.843），1.951(1.031～3.694)，1.253(0.825～

4、1.902)。分層分析結(jié)果:男性患者組G、GG頻率顯著高于同性別對照組(P=0.008,P=0.022),OR(95％CI)分別為1.849(1.174～2.911),3.152(1.143～8.692)。成人ITP組G、GG頻率顯著高于正常對照(P=0.042; P=0.048)，OR(95％CI)分別為1.410(1.012～1.964)，2.030(0.998～4.132)。慢性ITP組G、GG頻率較對照組有升高趨勢但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

5、（P=0.082，P=0.081）。女性對照組-1123G的發(fā)生頻率高于男性對照組，二者之間存在臨界顯著性差異(P=0.055)。
　　 結(jié)論:研究證實(shí)PTPN22-1123G＞C多態(tài)性和ITP遺傳易感性相關(guān)，G為ITP患病的風(fēng)險(xiǎn)等位基因，并且患病風(fēng)險(xiǎn)的高低和G等位基因攜帶率呈劑量依賴關(guān)系;-1123 G在各組ITP中起到的作用可能不同，我們的結(jié)果提示女性人群PTPN22-1123G的高水平分布可能是ITP在女性總體發(fā)病率較高的

6、遺傳學(xué)基礎(chǔ)之一;目前至少可以肯定-1123 G是男性ITP、成人ITP風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測因素;-1123 G可能對ITP病程的慢性轉(zhuǎn)歸具有一定預(yù)測價(jià)值，但該結(jié)論尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量證實(shí)。
　　 第二部分Ⅰ型干擾素系統(tǒng)基因多態(tài)性和免疫性血小板減少癥遺傳易感性關(guān)系的研究
　　 研究背景和目的:干擾素(interferons，IFNs)是調(diào)節(jié)機(jī)體初始免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的重要因素，研究表明在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合癥等自身免疫性疾病

7、發(fā)病機(jī)制中，Ⅰ型干擾素系統(tǒng)功能上調(diào)發(fā)揮至關(guān)重要的作用。干擾素調(diào)節(jié)因子5(interferon regulation factor5，IRF5)參與Ⅰ型干擾素分子的誘導(dǎo)生成及其效應(yīng)階段，是調(diào)控Ⅰ型干擾素分子和炎癥因子表達(dá)的最重要的轉(zhuǎn)錄因子;信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子4(signal transducer and activator of transcription4，STAT4)介導(dǎo)淋巴細(xì)胞對Ⅰ型干擾素、白介素-12(IL-12)、白介素-2

8、3(IL-23)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，調(diào)控Th1、Th17分化;酪氨酸激酶2(tyrosine kinase2，TYK2)通過與JAK2(Januskinase2)相互作用結(jié)合于Ⅰ型干擾素受體復(fù)合物，并啟動(dòng)JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，調(diào)控干擾素相關(guān)基因的表達(dá)。IRF5、STAT4、TYK2三者均是Ⅰ型干擾素系統(tǒng)的重要組分。免疫性血小板減少癥(ITP)是一種器官特異性自身免疫性疾病，有報(bào)道指出，ITP患者IFN信號(hào)通路功能存在異常。本研究

9、的目的是探討IRF5、STAT4、TYK2基因多態(tài)性和ITP遺傳易感性的關(guān)系。
　　 研究方法:病例對照研究。采用聚合酶鏈反應(yīng)-瓊脂糖凝膠電泳分離方法檢測IRF5基因3*/4*CGGGG、30bpIn/Del序列長度多態(tài)性位點(diǎn)基因型;采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法檢測rs3821236、rs2304256位點(diǎn)基因型;采用聚合酶鏈反應(yīng)-基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(PCR-MALDI-TOF

10、 MS)檢測rs10954231、rs7574865位點(diǎn)基因型。受試者共包括ITP患者159名，健康對照196名。
　　 結(jié)果:1）30bpIn/Del、rs7574865、 rs3821236及rs2304256位點(diǎn)的等位基因及基因型頻率分布在ITP組和正常對照組之間存在顯著性差異(P＜0.05);2)rs7574865、rs3821236之間存在連鎖不平衡關(guān)系，產(chǎn)生的兩種主要單元型在ITP及對照組間頻率分布存在顯著性差異[P

11、=0.04，OR=1.413(1.013-1.971); P=0.02，OR=0.707(0.525-0.951)];3）將患者依據(jù)性別、起病年齡及病程因素分組進(jìn)行分層分析，結(jié)果表明各位點(diǎn)與ITP發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性并不局限于特定的分組;4）協(xié)同分析表明，各位點(diǎn)之間存在協(xié)同作用，同時(shí)攜帶多位點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)等位基因?qū)⑻岣逫TP發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)
　　 結(jié)論:位于IRF5、STAT4、TYK2基因的多態(tài)性位點(diǎn)30bpIn/Del、rs7574865、rs

12、3821236及rs2304256和ITP的遺傳易感性相關(guān);且各位點(diǎn)之間能夠以協(xié)同作用方式增加ITP的患病風(fēng)險(xiǎn);IRF5、STAT4、TYK2基因是Ⅰ型干擾素系統(tǒng)的重要組分，推測Ⅰ型干擾素系統(tǒng)功能失調(diào)是ITP發(fā)病的重要機(jī)制
　　 課題二：
　　 Lman1基因復(fù)合雜合突變導(dǎo)致的凝血因子Ⅴ、Ⅷ聯(lián)合缺乏癥
　　 研究背景及目的:凝血因子Ⅴ、Ⅷ(FⅤ、FⅧ)聯(lián)合缺乏癥(F5F8D)是一種罕見的常染色體隱性遺傳性出血性疾

13、病。近年的研究發(fā)現(xiàn)該病病因在于基因lman1或mcfd2的突變。本研究的目的是對一個(gè)F5F8D先證者及其家系成員的lman1、mcfd2基因進(jìn)行擴(kuò)增、測序，以查找潛在的致病突變。
　　 研究方法:我們采集了先證者及其父母的外周血樣本，進(jìn)行了凝血功能相關(guān)檢查，包括活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)、血漿纖維蛋白原(Fg)、FⅤ促凝活性(FⅤ:C)、FⅧ促凝活性(FⅧ:C);并提取基因組DNA

14、，通過PCR法對先證者lman1基因的13個(gè)外顯子及側(cè)翼序列、mcfd2基因的4個(gè)外顯子及側(cè)翼序列進(jìn)行特異性擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)純化后直接測序，以檢測致病突變。根據(jù)先證者突變所在位點(diǎn)，選擇性擴(kuò)增其父、母的相應(yīng)片段，純化、測序，以便進(jìn)行家系分析。
　　 結(jié)果:先證者APTT82.2S，PT19.6S，TT18.6S，F(xiàn)g2.9g/l，F(xiàn)Ⅴ:C7.1％，F(xiàn)Ⅷ:C18.7％;先證者及其母親lman1基因第8外顯子區(qū)出現(xiàn)雜合性單堿基插入c.91