Notch1參與調(diào)節(jié)食管鱗狀細(xì)胞癌中Srcasm負(fù)調(diào)控活化Src酪氨酸激酶的機(jī)制研究.pdf

1、食管癌分布于世界各地,我國是食管癌的高發(fā)區(qū),食管癌死亡率占我國惡性腫瘤死亡率的21.8％,其中河南省食管癌死亡占全省總癌死亡的40％左右,平均每年因食管癌死亡約25000人。食管癌發(fā)生于食管粘膜上皮的基底細(xì)胞,在我國等食管癌的高發(fā)區(qū),病理類型以鱗狀上皮細(xì)胞癌為主,占95％左右,以食管鱗狀細(xì)胞癌為研究對象具有明顯的現(xiàn)實(shí)意義。雖然經(jīng)過數(shù)十年的研究我們認(rèn)為食管癌的發(fā)生與亞硝胺類化合物、微量元素的缺乏、遺傳易感性等因素有關(guān),但其確切的發(fā)病機(jī)制仍

2、然不清楚,這也是造成目前其治療效果不令人滿意的關(guān)鍵因素。食管粘膜表面被覆復(fù)層鱗狀上皮組織,正常食管粘膜上皮組織具有自我更新能力,維持上皮細(xì)胞生長與終止分化。而控制食管上皮組織從分化狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樵錾鸂顟B(tài)是我們解開食管上皮疾病的一把鑰匙,尤其在食管癌的發(fā)生機(jī)制研究方面意義重大。相關(guān)研究為我們探索食管癌的發(fā)生機(jī)制提供了可能,也為食管癌的基因治療提供了理論依據(jù)。
　　 SRC家族酪氨酸激酶(SFKs)包括至少9種結(jié)構(gòu)高度相似的非受體酪氨酸

3、激酶,分別是Src、Fyn、Yes、LcK、Hck、Lyn、Blk、Yrk、Fgr。Src酪氨酸激酶由N端豆蔻酰化序列、單一序列、SH2結(jié)構(gòu)域、SH3結(jié)構(gòu)域、激酶域、C端調(diào)節(jié)域等結(jié)構(gòu)組成。其籍N端豆蔻?；^定在質(zhì)膜內(nèi)側(cè)；SH2結(jié)構(gòu)域由約100個氨基酸殘基組成,專一性識別并結(jié)合含有磷酸酪氨酸的一段短肽；SH3結(jié)構(gòu)域由約50個氨基酸殘基組成,通過脯氨酸及疏水氨基酸殘基與靶蛋白結(jié)合；激酶域含正調(diào)節(jié)自磷酸化位點(diǎn)Y416；C端調(diào)節(jié)域含負(fù)調(diào)節(jié)磷酸化

4、位點(diǎn)Y527。SH3域在細(xì)胞骨架的重組裝及Src蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)方面具有重要意義,而SH2域和激酶域在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演重要的角色。在正常細(xì)胞中,由于羧基末端Src激酶(carboxyterminal Src kinase,CSK)的存在,Y527發(fā)生磷酸化,磷酸Y527和SH2域結(jié)合,使SFKs蛋白頭尾卷曲而處于抑制狀態(tài):但發(fā)生癌變或處于有絲分裂期的細(xì)胞,Y527解磷酸化和Y416自身磷酸化.使得SFKs蛋白處于開放構(gòu)象而被激活。
　　

5、 由于歷史的因?yàn)?Src酪氨酸激酶在腫瘤方面的研究多集中于鳥類及哺乳動物成纖維細(xì)胞以及人類造血系統(tǒng)細(xì)胞方面。最近,多項(xiàng)研究顯示Src酪氨酸激酶活性水平的異常升高與人類結(jié)腸癌、乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌等多種上皮起源腫瘤的發(fā)生相關(guān)。理論上,酪氨酸激酶活性突變和或負(fù)調(diào)控機(jī)制受損是腫瘤組織中其水平異常增高的可能機(jī)制,然而Src酪氨酸激酶活性突變在這些腫瘤中很少發(fā)生,故負(fù)調(diào)控機(jī)制受損可能是腫瘤組織中Src酪氨酸激酶水平異常增高的主要機(jī)制。Srcasm

6、是新近發(fā)現(xiàn)的Src酪氨酸激酶的作用底物和負(fù)調(diào)控因子,Notch1屬于Ⅰ型跨膜蛋白,在人皮膚鱗狀細(xì)胞癌中其可能參與Srcasm負(fù)調(diào)控Src酪氨酸激酶的作用機(jī)制。
　　 活化Src酪氨酸激酶(Tyr416)在食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中扮演了何種角色?在食管鱗狀細(xì)胞癌中是否存在Srcasm對其的負(fù)調(diào)控作用機(jī)制?人食管鱗狀細(xì)胞癌中Notch1是否也參與該負(fù)調(diào)控機(jī)制?本研究對此問題進(jìn)行探究,試圖發(fā)現(xiàn)其與食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的關(guān)系并揭示其可能

7、的負(fù)調(diào)控機(jī)制。
　　 本論文的內(nèi)容分為以下三部分:
　　 第一部分實(shí)驗(yàn)材料和方法介紹
　　 試劑配制方法參考《Experimental Directory of Medical College of Universityof Pennsylvania》。涉及的主要實(shí)驗(yàn)方法包括:免疫組織化學(xué)方法、細(xì)胞免疫熒光方法、組織免疫熒光方法、免疫印跡方法、腺病毒載體的感染、細(xì)菌的轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒DNA的抽提、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染、組織和細(xì)胞

8、蛋白質(zhì)的抽提等。
　　 第二部分活化Src酪氨酸激酶、Srcasm及Notch1與食管鱗狀細(xì)胞癌之間關(guān)系的研究
　　 目的:
　　 觀察食管鱗狀細(xì)胞癌中活化Src酪氨酸激酶、Srcasm和Notch1的表達(dá),探索它們與食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系。
　　 方法：
　　 1.免疫組織化學(xué)法觀察活化Src酪氨酸激酶、Srcasm和Notch1在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)。
　　 2.組織免疫

9、熒光法觀察活化Src酪氨酸激酶、Srcasm和Notch1在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)。
　　 3.免疫印跡法觀察活化Src酪氨酸激酶、Srcasm和Notch1在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)。
　　 4.細(xì)胞免疫熒光法觀察活化Src酪氨酸激酶、Srcasm和Notch1在人食管鱗狀細(xì)胞癌TE1細(xì)胞株和食管上皮細(xì)胞EPC2-htert細(xì)胞株中的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.Tyr416在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中高

10、表達(dá),在正常食管粘膜組織中低表達(dá)。
　　 2.Tyr416在人食管鱗狀細(xì)胞癌TE1和TE9細(xì)胞株中高表達(dá),在食管粘膜上皮細(xì)胞株EPC1-htert和EPC2-htert中低表達(dá)。
　　 3.Tyr416在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)高于正常食管粘膜組織,P<0.01,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 4.Srcasm在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中低表達(dá),在正常食管粘膜組織中高表達(dá)。
　　 5.Srcasm在人食管鱗狀細(xì)胞癌

11、TE1和TE9細(xì)胞株中低表達(dá),在食管粘膜上皮細(xì)胞株EPC1-htcrt和EPC2-htert中高表達(dá)。
　　 6.Srcasm在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)低于正常食管粘膜組織,P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 7.Notch1在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中低表達(dá),在正常食管粘膜組織中高表達(dá)。
　　 8.Notch1在人食管鱗狀細(xì)胞癌TE1和TE9細(xì)胞株中低表達(dá),在食管粘膜上皮細(xì)胞株EPC1-htert和EPC2-h

12、tert中高表達(dá)。
　　 9.Notch1在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)低于正常食管粘膜組織,P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.Tyr416在食管鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá),在正常食管粘膜組織中低表達(dá),提示Src酪氨酸激酶的活化在食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。
　　 2.Srcasm在食管鱗狀細(xì)胞癌中低表達(dá),在正常食管粘膜組織中高表達(dá),提示Srcasm可能在食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)

13、展過程中起負(fù)調(diào)控作用。
　　 3.Notch1在食管鱗狀細(xì)胞癌中低表達(dá),在正常食管粘膜組織中高表達(dá),提示Notch1可能在食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中起負(fù)調(diào)控作用,Notch1錨定于細(xì)胞膜的蛋白質(zhì),可能是食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生過程中一個重要的上游信號調(diào)控分子。
　　 第三部分食管鱗狀細(xì)胞癌中Srcasm負(fù)調(diào)控活化Src酪氨酸激酶的作用及其機(jī)制的研究
　　 目的:
　　 探索食管鱗狀細(xì)胞癌中活化Src酪氨酸激

14、酶的負(fù)調(diào)控機(jī)制和該機(jī)制包含的可能信號分子。
　　 方法：
　　 1.人pcDNA3.1-Srcasm質(zhì)粒DNA載體和人Srcasm腺病毒載體(Ad-Srcasm)轉(zhuǎn)染和感染人食管鱗狀細(xì)胞癌TE1細(xì)胞株,篩選較好的作用方法。
　　 2.人pcDNA3.1-Srcasm質(zhì)粒DNA載體轉(zhuǎn)染人食管鱗狀細(xì)胞癌TE1細(xì)胞株,觀察其對活化Src酪氨酸激酶的作用。
　　 3.pcDNA3.1-Notch1質(zhì)粒DNA載體轉(zhuǎn)

15、染人食管鱗狀細(xì)胞癌TE1細(xì)胞株,觀察其對Srcasm的作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.人pcDNA3.1-Srcasm質(zhì)粒DNA載體以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人食管鱗狀細(xì)胞癌TE1細(xì)胞株后,免疫印跡檢測Sreasm的表達(dá)增高。
　　 2.人Srcasm腺病毒載體(Ad-Srcasm)感染人食管鱗狀細(xì)胞癌TE1細(xì)胞株后,免疫印跡檢測Srcasm的表達(dá)增高。
　　 3.Quantity-one軟件測量灰度,并經(jīng)β-act

16、in標(biāo)準(zhǔn)化后,pcDNA3.1-Srcasm質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染組的Srcasm蛋白表達(dá)水平較Ad-Sreasm腺病毒感染組高。
　　 4.轉(zhuǎn)染遞加劑量的pcDNA3.1-Srcasm質(zhì)粒DNA,TE1細(xì)胞中Srcasm蛋白的表達(dá)逐漸增高,而Tyr416蛋白的表達(dá)逐漸減低。
　　 5.轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Notch1質(zhì)粒DNA,原來低表達(dá)Srcasm的TE1細(xì)胞株(見空白對照組和pcDNA3.1空載體組)中,Srcasm蛋白

17、的表達(dá)明顯增高。
　　 結(jié)論：
　　 1.pcDNA3.1-Srcasm質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染人食管鱗狀細(xì)胞癌TE1細(xì)胞株是成功的。
　　 2.人Srcasm腺病毒載體(Ad-Srcasm)感染人食管鱗狀細(xì)胞癌TE1細(xì)胞株是成功的。
　　 3.人食管鱗狀細(xì)胞癌TE1細(xì)胞株中pcDNA3.1-Srcasm質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較人Srcasm腺病毒載體(Ad-Srcasm)感染高。
　　 4.pcDNA3.1-

18、Notch1質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染和感染人食管鱗狀細(xì)胞癌TE1細(xì)胞株是成功的。
　　 5.人食管鱗狀細(xì)胞癌TE1細(xì)胞株中Srcasm對活化Src酪氨酸激酶具有負(fù)調(diào)控作用。
　　 6.人食管鱗狀細(xì)胞癌TE1細(xì)胞株中Notch1可能是Srcasm的上游信號分子。
　　 全文結(jié)論:
　　 1.活化Src酪氨酸激酶是食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生機(jī)制中的一個重要信號分子。
　　 2.在食管鱗狀細(xì)胞癌中Srcasm對活化Src