酪氨酸激酶C-Src在機械通氣肺損傷中的作用機制.pdf

1、目的:
　　機械通氣相關肺損傷（Ventilation induced-lung injury，VILI）是指在利用呼吸機進行機械通氣時，由于機械通氣的原因和肺部原發(fā)病交叉引起的急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)。機械因素通過破壞肺泡細胞膜的完整性，影響細胞膜的通透性，引起肺泡水腫，進而引起肺損傷。致密連接蛋白(Tightjunctions，TJs) Occludin是維持肺泡上皮通透性和屏障功能的重要連接蛋

2、白。因此，本研究通過體外實驗（周期性機械牽張小鼠肺泡上皮細胞）和體內實驗（不同潮氣量機械通氣）來模擬機械通氣相關肺損傷，觀察致密連接蛋白Occludin和酪氨酸激酶c-Src的表達;使用c-Src激酶抑制劑后，Occludin蛋白表達的變化及c-Src激酶磷酸化狀態(tài)，及c-Src激酶在VILI中的作用機制。
　　方法:
　　體外實驗:將單層培養(yǎng)的小鼠肺泡上皮細胞（MEL-12細胞）隨機分為5組，對照組（C組）、機械牽張組（S

3、組）、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)組（D組）、酪氨酸激酶(c-Src)抑制劑(PP2)組（P組）、小分子RNA干擾（siRNA-Occludin）組（Si組）。D組、P組在進行周期性機械牽張前30min用c-Src激酶抑制劑PP2(100umol/L)和DMSO(30ul/ml)進行預處理。C組未進行周期性機械牽張;S組以頻率0.5HZ，牽張幅度為8％、20％分別進行周期性機械牽張MLE-12細胞，D組、

4、P組以頻率0.5HZ，牽張幅度20％進行周期性機械牽張預處理后的MLE-12細胞，S組的牽張時間時間為1h、2h、4h，D組、P組的機械牽張時間為4h。Si組進行siRNA-Occludin預處理。預處理及周期性機械牽張后，一部分在冰上迅速進行蛋白裂解，提取總蛋白，用于Western Blotting檢測Occludin蛋白及c-Src激酶的表達;另一部分，用4％多聚甲醛固定10min，透膜封閉后，采用細胞免疫熒光觀察Occludin蛋

5、白的分布。
　　體內實驗:30只健康Wistar大鼠，體重250-300g，隨機分為5組，每組6只:對照組（C組），小潮氣量組（M組），大潮氣量組（H組），小潮氣量+c-Src激酶抑制劑組（M+P組），大潮氣量+c-Src激酶抑制劑組（H+P組）。C組大鼠不進行機械通氣;M組、H組、M+P組、H+P組均進行機械通氣，呼吸頻率均為40次/min，吸呼比(I∶E)為1∶2，吸入氧濃度為21％，通氣時間為4h。M組和M+P組潮氣量為7m

6、L/kg;H組和H+P組潮氣量為42mL/kg。M+P組和H+P組在麻醉前用c-Src激酶抑制劑PP2(1ug/kg)預處理1h。機械通氣后，記錄肺損傷評分;右肺上葉迅速放入液氮中，凍存?zhèn)鋀estern Blotting測Occludin蛋白及c-Src激酶;右肺其他部分固定于4％多聚甲醛中，做HE染色;左肺用來測干濕重比評價肺水腫(W/D)。
　　結果:
　　體外實驗:
　　1.免疫熒光發(fā)現，牽張幅度20％的周期性機

7、械牽張，Occludin表達呈時間依賴性，隨牽張時間的增長，Occludin表達減少，PP2預處理后，進行機械牽張，Occludin表達較未用PP2預處理多。
　　2.Western Blotting發(fā)現，S組中牽張幅度為8％的周期性機械牽張1h、2h、4h，與牽張0h相比，Occludin表達沒有明顯變化（P＞0.05）;S組中振幅為20％的周期性機械牽張1h、2h、4h，與牽張0h相比，c-Src激酶表達明顯升高（P＜0.05

8、），Occludin表達明顯降低（P＜0.05）;與S組中機械牽張4h比較，D組中機械牽張4h的Occludin沒有明顯改變（P＞0.05）;與S組中機械牽張4h比較，P組中機械牽張4h，Occludin表達升高（P＜0.05）。
　　體內實驗:
　　1.HE染色發(fā)現，大潮氣量機械通氣肺泡充血嚴重，出血，肺泡壁增厚，肺透明膜形成;加入PP2后進行大潮氣量機械通氣后，肺泡充血及出血減少，肺泡壁增厚減少;小潮氣量機械通氣肺泡變化

9、不明顯;
　　2.Western Blotting發(fā)現，與C組及M組比較，H組Occludin蛋白表達降低（P＜0.05）,總的和磷酸化的c-Src激酶表達均升高（P＜0.05）;與H組比較，H+P組Occludin蛋白表達升高（P＜0.05），總的和磷酸化的c-Src激酶表達均降低（P＜0.05）。
　　結論:
　　大潮氣量機械通氣導致機械通氣肺損傷，可能與酪氨酸激酶c-Src有關。c-Src激酶磷酸化導致c-Src