Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ?qū)Π螂滓菩屑?xì)胞癌T24細(xì)胞的抑制作用及其抑制機(jī)理的研究.pdf

1、膀胱癌是全球，也是我國最常見的泌尿生殖系惡性腫瘤。膀胱癌發(fā)病率占成人惡性腫瘤的8％，分別居男性、女性惡性腫瘤的第4和第8位。膀胱癌中上皮性腫瘤占98％，而移行細(xì)胞癌占上皮腫瘤的90％以上，臨床上占有重要的地位。膀胱移行細(xì)胞癌的特點(diǎn)是發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、治療較復(fù)雜；生物學(xué)行為多變，表淺癌容易復(fù)發(fā)、進(jìn)展，侵潤。對于膀胱移行細(xì)胞癌的治療，目前困擾臨床醫(yī)師最大的問題就是如何減少復(fù)發(fā)，如何控制腫瘤進(jìn)展。傳統(tǒng)方法有膀胱局部灌注化療、全身化療、免疫治

2、療等，但效果都不是很理想。近年來抗癌藥物治療研究的新方向轉(zhuǎn)向抑制腫瘤生長進(jìn)展中特異性通路和關(guān)鍵分子的分子靶向治療，而減少復(fù)發(fā)，控制腫瘤進(jìn)展是膀胱移行細(xì)胞癌的靶向治療藥物的研究方向。 Src（雞肉瘤病毒基因組中的基因，sarcomagene）是最早報(bào)道的癌基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中具有重要作用。研究提示c-Src在許多上皮和非上皮惡性腫瘤都出現(xiàn)過度表達(dá)和活性異常，c-Src的蛋白產(chǎn)物-非受體蛋白酪氨酸激酶c-Src家族在眾多信

3、號傳導(dǎo)通路中起著關(guān)鍵作用，影響著細(xì)胞的增殖、分化、遷移和存活，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，提示c-Src蛋白在調(diào)控細(xì)胞的生長、粘附、運(yùn)動和細(xì)胞信號傳導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞上c-Src激酶活性明顯升高。c-Src過度表達(dá)可促進(jìn)膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞向間質(zhì)遷移，增加其浸襲潛力。因此，我們選定c-Src作為潛在的腫瘤基因治療靶點(diǎn)，試圖通過此項(xiàng)研究，了解c-Src在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，了解c-Src蛋白產(chǎn)

4、物與膀胱移行細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的相關(guān)性。在此基礎(chǔ)上，研究Src酪氨酸激酶抑制劑對膀胱移行細(xì)胞癌T24細(xì)胞生長、增殖的影響，探討酪氨酸激酶抑制劑對Src蛋白及其下游信號的作用，論證Src蛋白作為膀胱移行細(xì)胞癌分子靶向治療的潛在靶點(diǎn)的可能性。 第一章Src蛋白在膀胱移行細(xì)胞癌（BTCC）上的表達(dá)及其意義目的：探討c-Src蛋白在膀胱移行細(xì)胞癌（BTCC）上的表達(dá)及其意義方法：用半定量RT-PCR的方法檢測36例膀胱移行細(xì)

5、胞癌（BTCC）中c-Src的表達(dá)情況，并分析其與膀胱移行細(xì)胞癌（BTCC）臨床病理因素的關(guān)系。同時(shí)取癌旁組織22例及正常膀胱組織18例做對照。 結(jié)果：BTCC（分淺表性膀胱癌和肌層侵潤性膀胱癌兩組）組織中c-SrcmRNA表達(dá)比值（c-Src/β-actin）分別為0.311±0.014、0.252±0.024，明顯高于癌旁組織中的0.150±0.032和正常膀胱組織的0.144±0.028，組間存在顯著差異（P<0.05）。

6、c-Src在復(fù)發(fā)患者中的表達(dá)比值（c-Src/β-actin）為0.329±0.103，明顯高于初發(fā)患者中的表達(dá)比值（c-Src/β-actin）0.288±0.121，組間存在顯著差異（P<0.05）具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；c-Src在膀胱移行細(xì)胞癌（BTCC）G1、G2、G3組其表達(dá)比值（c-Src/β-actin）分別為0.289±0.128，0.302±0.104和0.325±0.098存在明顯差異，G1組、G2分別與G3組比較，組間存

7、在顯著差異（P<0.05）具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1、c-Src及其蛋白在膀胱移行細(xì)胞癌（BTCC）存在明顯高表達(dá)。 2、c-Src及其蛋白的表達(dá)的強(qiáng)度與膀胱移行細(xì)胞癌（BTCC）的分化和分期密切相關(guān)，腫瘤分化越低、臨床分期越晚以及復(fù)發(fā)患者，c-Src及其蛋白的過表達(dá)越明顯，據(jù)此推測c-Src的過表達(dá)或高表達(dá)可能與膀胱移行細(xì)胞癌的侵襲、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 第二章Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ?qū)θ税螂滓菩屑?xì)胞

8、癌T24細(xì)胞生長、增殖的細(xì)胞生物學(xué)研究 目的：了解Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ?qū)θ税螂装㏕24細(xì)胞的抑制作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果及對其遷移能力影響。 方法：運(yùn)用Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ干預(yù)人膀胱癌T24細(xì)胞的體外生長，顯微鏡觀察法觀察T24細(xì)胞干預(yù)前后的生長情況，MTT法檢測存活率，Hoechst染色后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)（AnnexinV/PI雙染法）檢測凋亡比率，Transwell腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)來了解

9、Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ?qū)24細(xì)胞遷移的影響。 結(jié)果：Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ?qū)θ税螂装㏕24細(xì)胞有抑制作用，并且呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ能夠誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡，凋亡比率呈劑量依賴性關(guān)系。經(jīng)Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ干預(yù)后透過人工基底膜的T24細(xì)胞明顯減少。 結(jié)論：Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ?qū)δ軌蛞种苹驕p弱人膀胱癌T24細(xì)胞的生長、增殖、遷移/侵襲/轉(zhuǎn)移的能力，誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡。 第三章Sr

10、c酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ?qū)θ税螂滓菩屑?xì)胞癌T24細(xì)胞生長、增殖影響的分子生物學(xué)機(jī)理探討 目的：探討Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ?qū)rc蛋白及其下游信號的作用。 方法：半定量RT-PCR法檢測Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ處理后的人膀胱癌細(xì)胞T24各濃度組的c-Src、E-Cadherin、P38MAPK、MMP9基因表達(dá)的變化情況，使用Westernblot檢測Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ處理后T24細(xì)胞內(nèi)的c-Src蛋白（包括其磷酸化與

11、非磷酸化兩種類型）表達(dá)情況。 結(jié)果：Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ處理有下調(diào)后的人膀胱癌細(xì)胞T24各濃度組的c-SrcmRNA的表達(dá)有下調(diào)；E-Cadherin基因的表達(dá)呈逐漸上調(diào)趨勢；P38基因的表達(dá)呈逐漸下調(diào)趨勢；MMP9基因的表達(dá)有下調(diào)。處理后T24細(xì)胞內(nèi)c-Src基因在蛋白表達(dá)水平上其磷酸化類型隨Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ濃度的增高表達(dá)逐漸下降，并且呈劑量效應(yīng)關(guān)系。 結(jié)論： 1.Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ可能通過競

12、爭Src蛋白磷酸化位點(diǎn)，使其不能激活，從而導(dǎo)致下游的細(xì)胞傳導(dǎo)途徑失活使得T24細(xì)胞增殖得到抑制，認(rèn)為Src蛋白具有作為膀胱移行細(xì)胞癌分子靶向治療的潛在靶點(diǎn)的可能性。 2.Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ特異性地阻止Src蛋白磷酸化后使得E-鈣粘連蛋白表達(dá)上調(diào)，活性增高，從而使人膀胱癌T24細(xì)胞間依賴于鈣粘連蛋白的細(xì)胞間粘連增強(qiáng)，致使細(xì)胞向外侵潤、遷移能力下降。 3.Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ可能可以通過阻止Src蛋白激活影響其下游

13、的Ras/Raf/MEK/MAPK（ERK1/2或p38）通路和ERK1/2和p38細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路，下調(diào)p38表達(dá)不僅直接和間接的誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡，而且可以阻止或減少T24細(xì)胞的遷移、擴(kuò)散和穿膜侵襲的發(fā)生。 4.Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ可能通過影響C-Src介導(dǎo)的AP-1位點(diǎn)下游的GT盒對MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄啟動子發(fā)揮作用來實(shí)現(xiàn)其在轉(zhuǎn)錄水平上對MMP9的表達(dá)調(diào)節(jié)，使得MMP9基因在mRNA表達(dá)水平上下調(diào)，從而抑制T24細(xì)胞的