鈣信號(hào)與HIF在缺氧肺動(dòng)脈平滑肌增殖中的作用探討.pdf

1、氧是維持人類生命活動(dòng)所必須的基本物質(zhì)之一。缺氧是高原病的直接原因，也是多種疾病發(fā)生和發(fā)展的過(guò)程中常見(jiàn)的病理生理過(guò)程。急性和慢性缺氧均可以導(dǎo)致缺氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)，后者病理生理基礎(chǔ)是肺動(dòng)脈的收縮反應(yīng)增強(qiáng)和血管壁結(jié)構(gòu)改建(remodeling)。對(duì)于Ca<'2+>與缺氧性肺血管收縮的關(guān)系已經(jīng)進(jìn)行了大量研究。目前認(rèn)為，缺氧時(shí)線粒體電子傳遞降低，電壓門控K<'+>通道(Kv通道

2、)周圍活性氧水平發(fā)生改變，使Kv通道受抑制(特別是Kv1.5和Kv2.1)，導(dǎo)致膜電位降低，Ca<'2+>內(nèi)流增加，從而引起肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)收縮，進(jìn)而導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓升高。但是細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>穩(wěn)態(tài)失衡與肺血管結(jié)構(gòu)改建的關(guān)系尚不明確，特別是Ca<'2+>信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中哪些環(huán)節(jié)起主要調(diào)節(jié)作用還不清楚。從本質(zhì)上說(shuō)，肺血管結(jié)構(gòu)改建是缺氧作用下肺血管進(jìn)行一系

3、列基因表達(dá)重新調(diào)整，進(jìn)而其結(jié)構(gòu)、功能、代謝發(fā)生重新調(diào)重的結(jié)果。證據(jù)表明，缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)是介導(dǎo)機(jī)體對(duì)缺氧發(fā)生基因表達(dá)重新調(diào)整的中心環(huán)節(jié)。最早在1992年發(fā)現(xiàn)HIF-1，隨后相繼發(fā)現(xiàn)了HIF-2、3、4，它們是分別由不同的α亞基和相同的β亞基構(gòu)成的異二聚。眾多的研究證明HIF參與HPH的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，可能主要從下述兩方面發(fā)揮作用：1)增加縮血管物質(zhì)的生成，減少擴(kuò)血管物質(zhì)的生成；2)促

4、進(jìn)肺動(dòng)脈的重構(gòu)。但是各家研究結(jié)果并不一致，很多環(huán)節(jié)尚待闡明。既然Ca<'2+>穩(wěn)態(tài)失衡和HIF水平改變分別是細(xì)胞對(duì)缺氧發(fā)生反應(yīng)在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)水平的兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，那么有理由推測(cè)二者之間可能存在密切關(guān)系，共同參與細(xì)胞對(duì)缺氧反應(yīng)的調(diào)節(jié)。本研究在PASMCs缺氧模型上，研究HIF表達(dá)的時(shí)相特點(diǎn)，應(yīng)用Ca<'2+>信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)不同環(huán)節(jié)的工具藥物，探討Ca<'2+>信號(hào)通路如何參與缺氧性PASMCs增殖，并初步探討鈣信號(hào)是否與HIF-2α有一

5、定關(guān)聯(lián)。 方法： 組織塊法培養(yǎng)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，細(xì)胞長(zhǎng)到一定數(shù)量時(shí)，分為常氧組和缺氧組，應(yīng)用MTT檢測(cè)細(xì)胞活性，初步判斷6 h、12 h、24 h、48 h中哪個(gè)為檢測(cè)細(xì)胞增殖的最佳時(shí)間點(diǎn)。為了觀察鈣信號(hào)通路與缺氧誘導(dǎo)的PASMCs增殖的關(guān)系，將細(xì)胞同步化后分成常氧組、缺氧組、缺氧+L-型鈣通道阻滯劑硝苯吡啶(nifedipine，NFD 10μM)組、缺氧+鈣調(diào)素拮抗劑三氟拉嗪(trifluoperazine，TFP

6、10μM)組、缺氧+核轉(zhuǎn)錄因子NF-кB抑制劑PDTC(20μM)組、缺氧+細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA/AM(20 μM)組，缺氧及其缺氧加藥組放入2％氧濃度的缺氧培養(yǎng)，一段時(shí)間后，取出細(xì)胞進(jìn)行各組細(xì)胞MTT檢測(cè)活性，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布，免疫熒光檢測(cè)PCNA表達(dá)。 為了研究PASMCs的HIF的時(shí)相表達(dá)特點(diǎn)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到一定數(shù)量時(shí)，去血清同步化處理，分為常氧組和缺氧組，分別培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h后取出

7、，提取RNA和蛋白，用RT-PCR方法檢測(cè)各組HIF-1α、HIF-2α、HIF-β mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)其個(gè)時(shí)間點(diǎn)的蛋白表達(dá)。 細(xì)胞同步化處理后，分為常氧組和缺氧組，各組內(nèi)再分別設(shè)對(duì)照組、NFP(10μM)組、T-型鈣通道阻滯劑鹽酸阿米洛利(amiloride hydrochaeridae，100μM)組、BAPTA/AM(15μM)組以及TFP(7.5μM)組，培養(yǎng)24 h后，檢測(cè)各個(gè)工具藥物對(duì)于HIF

8、-2α表達(dá)的影響，以初步確定鈣信號(hào)通路與HIF的關(guān)系。 結(jié)果： 1．MTT檢測(cè)細(xì)胞活性，細(xì)胞缺氧后與常氧組相比活性可見(jiàn)不同程度增高，但是在缺氧12 h時(shí)，缺氧和常氧組的差異最明顯，所以選擇12 h為檢測(cè)工具藥的作用時(shí)間點(diǎn)。 2．MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，與常氧組相比，2％氧濃度培養(yǎng)PASMCs 12 h，細(xì)胞活力增加。L-型鈣通道阻滯劑、細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>螯合劑、CaM拮抗劑和NF-кB抑制劑等各加藥組細(xì)胞活力與缺氧

9、組相比均受到不同程度的抑制，其中NFD、BAPTA和PDTC各組細(xì)胞活力接近常氧組的水平(與常氧組相比)，而TFP組細(xì)胞活力降低最為顯著，且與常氧組相比細(xì)胞活力顯著降低。 3．流式細(xì)胞測(cè)定結(jié)果顯示，與常氧對(duì)照組相比，缺氧組G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低，S和G2/M期細(xì)胞比例均顯著增加。根據(jù)公式細(xì)胞增殖指數(shù)(proliferation index)：PI=(S+G2/M)/(S+G2/M+G0/G1)計(jì)算結(jié)果顯示，缺氧狀態(tài)下PI比

10、常氧組增加了約1.46倍(P<0.01)，L-型鈣通道阻滯劑、細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>螯合劑、CaM拮抗劑和NF-кB抑制劑等各工具藥物均可顯著抑制缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞細(xì)胞增殖，且各藥物刺激組與常氧組相比也均有顯著性抑制作用。 4．免疫熒光照片可見(jiàn)，2％缺氧組與常氧組相比，熒光強(qiáng)度明顯增加，L-型鈣通道阻滯劑、細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>螯合劑、CaM拮抗劑和NF-кB抑制劑均可顯著抑制缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞PCNA的表達(dá)量。 5．圖像分析顯示缺

11、氧對(duì)于HIF-1/2α、HIF-β的mRNA表達(dá)未見(jiàn)受缺氧和培養(yǎng)時(shí)間影響。常氧條件各時(shí)間點(diǎn)mRNA的表達(dá)量與在缺氧對(duì)應(yīng)條件時(shí)間點(diǎn)下的表達(dá)量未見(jiàn)顯著差異，而且缺氧和常氧各自時(shí)間點(diǎn)間的表達(dá)差異也未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 6．常氧條件下，僅有微量HIF-1α蛋白表達(dá)，但因表達(dá)量很低無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。缺氧后，HIF-1α表達(dá)量大幅度增加，大約在48 h達(dá)到高峰，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，表達(dá)量急劇下降。常氧條件下，HIF-2α蛋白就有少量表達(dá)，缺氧后表

12、達(dá)量迅速達(dá)高峰，且其在缺氧12 h、24 h、48 h、72 h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量未見(jiàn)顯著差異。HIF-β無(wú)論是在缺氧還是在常氧條件下均可見(jiàn)大量表達(dá)，且表達(dá)量不隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而改變；常氧和缺氧各個(gè)對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)之間其條帶的灰度值雖然有一定浮動(dòng)，但是其差異也未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。 7．常氧條件下，NFP、Amiloride、BAPTA/AM、CaM抑制劑TFP對(duì)于HIF-2αmRNA的表達(dá)未見(jiàn)顯著影響。與缺氧組不加藥物組相比，缺氧+Ami

13、loride、缺氧+BAPTA/AM、缺氧+TFP的HIF-2α mRNA的表達(dá)呈不同程度的抑制。 8．常氧條件下，NFP、Amiloride對(duì)HIF-2α的蛋白表達(dá)量未見(jiàn)明顯抑制作用，而B(niǎo)APTA/AM、TFP對(duì)于HIF-2α的蛋白表達(dá)量呈顯著抑制作用。與常氧條件下相同，缺氧+BAPTA/AM、缺氧+TFP對(duì)于HIF-2α的蛋白表達(dá)呈顯著的抑制作用，NFP和Amiloride對(duì)于低氧條件下的PASMCs HIF-2α的表達(dá)影響

14、不明顯。 結(jié)論： 1．鈣信號(hào)參與調(diào)節(jié)缺氧引起的PASMCs增殖，其中CaM和NF-кB為兩個(gè)重要的調(diào)節(jié)點(diǎn)。 2．PASMCs的HIF-β的mRNA以及蛋白表達(dá)呈固有型表達(dá)特點(diǎn)，不受缺氧刺激所影響。 3．缺氧刺激后，PASMCs的HIF-1α、HIF-2α mRNA表達(dá)量未見(jiàn)顯著變化，而蛋白水平大幅度上升，其中HIF-1α蛋白約在48 h達(dá)到高峰，然后迅速回降，HIF-2α則在缺氧12 h后即達(dá)高峰并維持在