Profilin-1在血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖中的作用.pdf

1、第一章自發(fā)性高血壓大鼠中profilin-1的表達(dá)。
　　 研究目的：
　　 Profilin-1是一種小分子量的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，廣泛存在于除骨骼肌之外的機(jī)體組織，可調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白聚合及解聚過程；參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和運(yùn)動(dòng)過程以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。許多研究顯示，profilin-1在冠心病、高血壓、糖尿病等心血管疾病的發(fā)生中起重要作用。有研究顯示過表達(dá)profilin-1的FVB/N小鼠主動(dòng)脈profilin-1蛋白水平增加

2、，主動(dòng)脈血管壁出現(xiàn)明顯的肥厚征兆，且profilin-1過表達(dá)小鼠從出生后6個(gè)月開始收縮壓和平均動(dòng)脈壓顯著增高。
　　 方法：
　　 選取12周齡雄性自發(fā)高血壓大鼠24只，隨機(jī)分為三組，即SHR組，低劑量氯沙坦組(Los(L))及高劑量氯沙坦組(Los(H))每組8只；以性別、周齡匹配的WKY(Wistar Kyoto rats)大鼠8只作為對照。其中Los(L)組給予15mg/kg/d的氯沙坦灌胃，Los(H)組給予3

3、0mg/kg/d的氯沙坦灌胃，SHR組及WKY組給予等體積的生理鹽水灌胃，常規(guī)喂養(yǎng)至20周后終止實(shí)驗(yàn)。開始及每周測量大鼠尾動(dòng)脈壓。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，抽血分離血漿檢測血管緊張素Ⅱ(AngiotensionⅡ，AngⅡ)，麻醉后取胸主動(dòng)脈及腸系膜三級(jí)動(dòng)脈，行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色。利用計(jì)算機(jī)輔助成像系統(tǒng)測算動(dòng)脈中層厚度(media thickness，MT)，管腔直徑(lumen diame

4、ter，LD)，厚度/腔徑(MT/MD)，動(dòng)脈中膜細(xì)胞平均核面積，免疫組織化學(xué)染色檢測profilin-1抗原在動(dòng)脈壁的表達(dá)。提取胸主動(dòng)脈mRNA及蛋白，采用Real-Time PCR及Western-Blot方法測量大鼠胸主動(dòng)脈profilin-1 mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、SHR組收縮期血壓(systolic blood pressure，SBP)明顯高于WKY組(P<0.01)，Los(L)組

5、及Los(H)組SBP較同期SHR者明顯降低，且Los(H)組SBP降低幅度更大(P<0.01)。
　　 2、處理結(jié)束后檢測SHR大鼠血漿AngⅡ水平明顯高于WKY組(P<0.01)，Los(L)組及Los(H)組，AngⅡ較SHR組明顯升高，且Los(H)組升高幅度更大(P<0.01)。
　　 3、HE染色顯示SHR組胸主動(dòng)脈及腸系膜動(dòng)脈重構(gòu)明顯，Los(L)組及Los(H)組結(jié)果顯示氯沙坦可部分防止高血壓的血管重構(gòu)。

6、SHR組腸系膜動(dòng)脈MT、LD、MT/LD及中膜血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)平均核面積較WKY組大鼠顯著增大，Los(L)組及Los(H)組結(jié)果顯示氯沙坦可部分預(yù)防重構(gòu)發(fā)生。
　　 4、SHR胸主動(dòng)脈及腸系膜動(dòng)脈profilin-1染色明顯高于WKY組，Los(L)組及Los(H)組結(jié)果顯示氯沙坦可降低SHR動(dòng)脈profilin-1的表達(dá)。
　　 5、SHR胸主動(dòng)脈

7、profilin-1 mRNA及蛋白表達(dá)明顯高于WKY大鼠(P<0.05)，Los(L)組及Los(H)組profilin-1 mRNA表達(dá)介于SHR組與WKY組之間。
　　 結(jié)論：
　　 SHR大鼠胸主動(dòng)脈及腸系膜動(dòng)脈profilin-1表達(dá)明顯增加，氯沙坦治療可降低profilin-1表達(dá)。
　　 第二章 AngⅡ干預(yù)平滑肌細(xì)胞后profilin-1表達(dá)變化。
　　 研究目的：
　　 在高血壓

8、發(fā)病過程中血管重構(gòu)是其重要特征，包括內(nèi)皮功能失調(diào)，血管平滑肌細(xì)胞增生，血管內(nèi)徑明顯減少，中膜橫截面積增加，平均細(xì)胞核面積增加等。
　　 血管緊張素Ⅱ在正常情況下對維持血壓有良好的作用，但是在病理情況下，產(chǎn)生過多時(shí)會(huì)引起血壓升高及心臟及血管重構(gòu)，從而導(dǎo)致靶器官的損害。
　　 本文第一章研究提示在SHR中，可見血漿AngⅡ水平明顯升高，胸主動(dòng)脈及腸系膜動(dòng)脈存在明顯的血管重構(gòu)及profilin-1表達(dá)增加，氯沙坦處理可部分抑制

9、血管重構(gòu)及profilin-1的增加。
　　 本章采用外源性AngⅡ干預(yù)大鼠血管平滑肌細(xì)胞株(rat vascularsmooth muscle cells，RVSMC)，觀察RVSMC細(xì)胞增殖情況及profilin-1的表達(dá)情況，并采用氯沙坦干預(yù)觀察其對RVSMC細(xì)胞增殖情況及profilin-1表達(dá)的影響，以進(jìn)一步明確profilin-1在平滑肌細(xì)胞增殖中是否起作用。
　　 方法：
　　 培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細(xì)

10、胞株，分別用不同濃度(0，10-8M，10-7M，10-6M)AngⅡ處理不同時(shí)間(6h，12h，18h，24h)，采用MTT法及流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期法觀察大鼠血管平滑肌細(xì)胞的增殖情況；采用Western-Blot法檢測大鼠血管平滑肌細(xì)胞profilin-1蛋白的表達(dá)。低劑量(10-6M)及高劑量(10-5M)氯沙坦預(yù)處理大鼠血管平滑肌細(xì)胞1h后給予AngⅡ終濃度10-6M處理24h，采用MTT法及流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期法觀察大鼠血管

11、平滑肌細(xì)胞的增殖情況；采用Western-Blot法檢測大鼠血管平滑肌細(xì)胞profilin-1蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、AngⅡ可呈濃度及劑量依賴性的促進(jìn)大鼠血管平滑肌細(xì)胞的增殖，以10-6MAngⅡ處理大鼠血管平滑肌細(xì)胞24h后最為顯著。
　　 2、氯沙坦預(yù)處理大鼠血管平滑肌細(xì)胞1h后，加入10-6M AngⅡ繼續(xù)處理細(xì)胞24h后，可見大鼠平滑肌細(xì)胞增殖能力明顯下降。
　　 3、AngⅡ可呈

12、濃度及劑量依賴性的上調(diào)大鼠血管平滑肌細(xì)胞profilin-1的表達(dá)，以10-6M AngⅡ處理大鼠血管平滑肌細(xì)胞24h后最為顯著。
　　 4、氯沙坦預(yù)處理大鼠血管平滑肌細(xì)胞1h后，加入10-6M AngⅡ繼續(xù)處理細(xì)胞24h后，可見氯沙坦可顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的profilin-1蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 AngⅡ可呈濃度及劑量依賴性的上調(diào)大鼠血管平滑肌細(xì)胞profilin-1的表達(dá)，氯沙坦預(yù)處理可顯著抑制

13、AngⅡ誘導(dǎo)的profilin-1蛋白的表達(dá)。
　　 第三章沉默profilin-1基因后AngⅡ處理平滑肌細(xì)胞后功能變化：
　　 研究目的：
　　 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指由外源或內(nèi)源性的雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞而引起的與dsRNA同源的mRNA降解，進(jìn)而抑制相應(yīng)的基因表達(dá)。本章采用RNA干擾技術(shù)將大鼠血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)profili

14、n-1基因沉默后，觀察AngⅡ?qū)π碌募?xì)胞系增殖功能的影響，進(jìn)一步明確profilin-1在大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖中的作用，進(jìn)而為研究高血壓血管霞構(gòu)的機(jī)制提供新的思路。
　　 JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是一種壓力反應(yīng)性途徑，一般情況信號(hào)通過細(xì)胞表面受體傳入細(xì)胞核，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。有研究顯示AngⅡ可通過結(jié)合AngⅡ受體而激活JAK家族中的JAK2和TYK2，進(jìn)而使STAT蛋白的磷酸化水平增強(qiáng)(STAT1α/h，STAT2 an

15、d STAT3)。另有研究指出JAK2在AngⅡ誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖中期關(guān)鍵作用。本章研究了阻斷JAK2/STAT3途徑對AngⅡ誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖的影響及對profilin-1表達(dá)的影響，初步探討profilin-1影響血管平滑肌細(xì)胞增殖的機(jī)制。
　　 方法：
　　 培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細(xì)胞株，并由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成profilin-1 siRNA質(zhì)粒，采用FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑將profilin-1

16、siRNA質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染大鼠血管平滑肌細(xì)胞株，采用Real-Time PCR及Western-Blot法檢測profilin-1基因沉默效果；AngⅡ以終濃度10-6M處理該細(xì)胞系，采用MTT法及流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期法觀察大鼠血管平滑肌細(xì)胞的增殖情況。JAK2/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑預(yù)處理正常大鼠血管平滑肌細(xì)胞株1h后給予AngⅡ終濃度10-6M處理24h，采用MTT法及流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期法觀察大鼠血管平滑肌細(xì)胞的增殖情況；采

17、用Western-Blot法檢測大鼠血管平滑肌細(xì)胞profilin-1蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、利用FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑成功建立了profilin-1基因沉默的大鼠血管平滑肌細(xì)胞株，其profilin-1基因表達(dá)明顯下調(diào)。
　　 2、沉默profilin-1基因后，AngⅡ誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖能力下降。
　　 3、采用JAK/STAT3抑制劑阻斷JAK/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑后，AngⅡ誘