肺動脈平滑肌細胞STIM1-Orai1相互作用初步研究.pdf

1、目的：
　　研究STIM1、Orai1蛋白在原代培養(yǎng)的正常大鼠肺動脈平滑肌細胞（Pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs）上的表達和相互作用關系，為肺動脈高壓研究提供基礎實驗依據。
　　方法：
　　利用PCR技術獲得STIM1、Orai1基因，分別與載體pLV-c-flag、pLV-c-HA連接，構建慢病毒載體pLV-c-flag-STIM1、pLV-c-HA-Orai1；

2、將慢病毒載體pLV-c-flag-STIM1、pLV-c-HA-Orai1感染大鼠PASMCs，Western-blot檢測感染前后STIM1、Orai1蛋白表達；鈣熒光測定大鼠PASMCs，觀察鈣池操縱性Ca2+內流；利用免疫熒光結合激光共聚焦技術對flag、HA標簽蛋白進行共定位，觀察經Ca2+釋放激動劑（CPA）處理前后STIM1、Orai1蛋白位置變化；分別用STIM1、Orai1抗體進行免疫共沉淀，觀察大鼠PASMCs中STI

3、M1、Orai1兩種蛋白的相互作用關系。
　　結果：
　　重組載體pLV-c-flag-STIM1、pLV-c-HA-Orai1經雙酶切、測序鑒定正確；將慢病毒載體 pLV-c-flag-STIM1、pLV-c-HA-Orai1感染原代培養(yǎng)大鼠PASMCs，Western-blot檢測STIM1、Orai1蛋白表達量明顯增高，具有統(tǒng)計學意義；免疫熒光對標簽蛋白flag、HA進行共定位，激光共聚焦顯微鏡觀察到STIM1存在于胞