原發(fā)性肝癌組織中經(jīng)典HLAⅠ類等位基因特異性mRNA表達與肝癌細胞免疫逃逸相關性的研究.pdf

1、經(jīng)典HLAⅠ類基因包括HLA-A、-B、-C三個座位，在人群中具有高度多態(tài)性，每個基因座位來自父母的兩種等位基因產(chǎn)物共顯表達于有核細胞表面，作為NK細胞和CTL的重要配體在調節(jié)免疫效應細胞功能中發(fā)揮著重要作用。
　　細胞毒性T細胞（CytotoxicityT lymphocyte，CTL）和自然殺傷(Natural Killer,NK)細胞是免疫監(jiān)視中最重要的兩類效應細胞。HLAⅠ類分子在調節(jié)CTL和NK細胞的殺傷功能中均發(fā)揮了關

2、鍵作用。CTL殺傷靶細胞時必須首先識別HLAⅠ類分子遞呈的抗原肽，即T細胞的MHC限制性。因此經(jīng)典HLAⅠ類分子表達缺失或降低有利于腫瘤細胞對CTL的免疫逃逸。NK細胞表面表達的抑制性殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(killer cellimmunoglobulin-like receptor，KIR)，與經(jīng)典HLAⅠ類分子結合后抑制NK細胞的活化。因此HLAⅠ類分子表達上調或者不變有利于腫瘤細胞對NK細胞的免疫逃逸。
　　在絕大多數(shù)腫

3、瘤中，經(jīng)典HLAⅠ類分子表達缺失或降低，使得腫瘤細胞逃逸CTL殺傷;而在肝癌中發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)肝癌組織的經(jīng)典HLAⅠ類分子表達上調或不變。不同于外周血及其他臟器，肝臟中NK細胞的比例約30％，和T細胞數(shù)目相當，在NK細胞和CTL的雙重免疫監(jiān)視下，肝癌細胞必須具有獨特的免疫逃逸機制。由于經(jīng)典HLAⅠ類分子與KIR分子均具有高度多態(tài)性，不同等位基因編碼的經(jīng)典HLAⅠ類分子在調節(jié)NK細胞的殺傷活性中發(fā)揮了不同作用，因此，為了逃逸NK細胞和CTL

4、的殺傷，肝癌中可能存在HLAⅠ類等位基因的選擇性異常表達，即同一位點的兩條等位基因表達水平變化不同。目前肝癌中經(jīng)典HLAⅠ類等位基因表達水平的檢測未見報道。
　　我們以原發(fā)性肝細胞癌為研究對象，首先對肝癌組織標本HLA基因和KIR基因進行分型，根據(jù)HLA分型結果設計HLA-A，-B，-C等位基因特異性定量PCR引物并驗證，然后通過real time PCR對72例原發(fā)性肝癌組織樣本進行HLAⅠ類等位基因mRNA表達的檢測，結合KI

5、R分型結果探討肝癌細胞的免疫逃逸機制。研究結果如下:
　　1.本實驗利用PCR-SBT方法完成HLA-A、-B、-C基因分型的樣本例數(shù)分別為40例、31例、72例;PCR-SSP方法完成33例樣本的12個KIR基因分型。
　　2.本實驗完成HLA-A/C等位基因特異性定量PCR引物的設計與驗證，共設計完成符合實驗要求的20對HLA-C和4對HLA-A等位基因特異性定量PCR引物。
　　3.本實驗完成80個HLA-A，6

6、2個HLA-B及144個HLA-C等位基因mRNA在肝癌和癌旁組織中表達水平的檢測。結合本實驗室前期的研究結果，共統(tǒng)計了144個HLA-A、140個HLA-B、144個HLA-C等位基因mRNA定量表達的結果，其中肝癌相比于癌旁， HLA-A等位基因上調表達36.11％，表達一致47.92％，下調表達15.97％; HLA-B等位基因上調表達26.43％，表達一致43.57％，下調表達30％;HLA-C等位基因上調表達27.78％，表達

7、一致41.67％，下調表達30.55％。
　　4.作為抑制性KIR配體的HLA-Bw4表達上調比例(45.46％)高于非KIR配體的HLA-Bw6表達上調比例(20.95％)，具有統(tǒng)計學差異(P=0.006)。抑制性KIR配體HLA-C*03在NK細胞活性高的KIR-BX個體中上調比例(62.5％)高于KIR-AA個體中的上調比例(14.29％)，具有統(tǒng)計學差異(P=0.011)。
　　綜合以上實驗結果，我們設計并驗證完成經(jīng)

8、典HLAⅠ類等位基因特異性的定量PCR引物，能夠定量分析同一HLA基因座位不同等位基因mRNA表達水平。在72例肝癌和癌旁組織中的研究結果表明，肝癌細胞中存在經(jīng)典HLAⅠ類等位基因選擇性得異常表達，且抑制NK細胞活性的HLA等位基因選擇性高表達，可能是肝癌細胞在NK細胞與CTL雙重免疫壓力下的免疫逃逸機制之一。
　　經(jīng)典HLAⅠ類等位基因特異性定量PCR引物的設計為同一HLA基因座位不同等位基因mRNA表達的定量定性分析提供了方法