原發(fā)性肝癌組織中經(jīng)典HLAⅠ類等位基因特異性mRNA表達(dá)與肝癌細(xì)胞免疫逃逸相關(guān)性的研究.pdf

1、經(jīng)典HLAⅠ類基因包括HLA-A、-B、-C三個(gè)座位，在人群中具有高度多態(tài)性，每個(gè)基因座位來自父母的兩種等位基因產(chǎn)物共顯表達(dá)于有核細(xì)胞表面，作為NK細(xì)胞和CTL的重要配體在調(diào)節(jié)免疫效應(yīng)細(xì)胞功能中發(fā)揮著重要作用。
　　細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CytotoxicityT lymphocyte，CTL）和自然殺傷(Natural Killer,NK)細(xì)胞是免疫監(jiān)視中最重要的兩類效應(yīng)細(xì)胞。HLAⅠ類分子在調(diào)節(jié)CTL和NK細(xì)胞的殺傷功能中均發(fā)揮了關(guān)

2、鍵作用。CTL殺傷靶細(xì)胞時(shí)必須首先識(shí)別HLAⅠ類分子遞呈的抗原肽，即T細(xì)胞的MHC限制性。因此經(jīng)典HLAⅠ類分子表達(dá)缺失或降低有利于腫瘤細(xì)胞對(duì)CTL的免疫逃逸。NK細(xì)胞表面表達(dá)的抑制性殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(killer cellimmunoglobulin-like receptor，KIR)，與經(jīng)典HLAⅠ類分子結(jié)合后抑制NK細(xì)胞的活化。因此HLAⅠ類分子表達(dá)上調(diào)或者不變有利于腫瘤細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞的免疫逃逸。
　　在絕大多數(shù)腫

3、瘤中，經(jīng)典HLAⅠ類分子表達(dá)缺失或降低，使得腫瘤細(xì)胞逃逸CTL殺傷;而在肝癌中發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)肝癌組織的經(jīng)典HLAⅠ類分子表達(dá)上調(diào)或不變。不同于外周血及其他臟器，肝臟中NK細(xì)胞的比例約30％，和T細(xì)胞數(shù)目相當(dāng)，在NK細(xì)胞和CTL的雙重免疫監(jiān)視下，肝癌細(xì)胞必須具有獨(dú)特的免疫逃逸機(jī)制。由于經(jīng)典HLAⅠ類分子與KIR分子均具有高度多態(tài)性，不同等位基因編碼的經(jīng)典HLAⅠ類分子在調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的殺傷活性中發(fā)揮了不同作用，因此，為了逃逸NK細(xì)胞和CTL

4、的殺傷，肝癌中可能存在HLAⅠ類等位基因的選擇性異常表達(dá)，即同一位點(diǎn)的兩條等位基因表達(dá)水平變化不同。目前肝癌中經(jīng)典HLAⅠ類等位基因表達(dá)水平的檢測(cè)未見報(bào)道。
　　我們以原發(fā)性肝細(xì)胞癌為研究對(duì)象，首先對(duì)肝癌組織標(biāo)本HLA基因和KIR基因進(jìn)行分型，根據(jù)HLA分型結(jié)果設(shè)計(jì)HLA-A，-B，-C等位基因特異性定量PCR引物并驗(yàn)證，然后通過real time PCR對(duì)72例原發(fā)性肝癌組織樣本進(jìn)行HLAⅠ類等位基因mRNA表達(dá)的檢測(cè)，結(jié)合KI

5、R分型結(jié)果探討肝癌細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制。研究結(jié)果如下:
　　1.本實(shí)驗(yàn)利用PCR-SBT方法完成HLA-A、-B、-C基因分型的樣本例數(shù)分別為40例、31例、72例;PCR-SSP方法完成33例樣本的12個(gè)KIR基因分型。
　　2.本實(shí)驗(yàn)完成HLA-A/C等位基因特異性定量PCR引物的設(shè)計(jì)與驗(yàn)證，共設(shè)計(jì)完成符合實(shí)驗(yàn)要求的20對(duì)HLA-C和4對(duì)HLA-A等位基因特異性定量PCR引物。
　　3.本實(shí)驗(yàn)完成80個(gè)HLA-A，6

6、2個(gè)HLA-B及144個(gè)HLA-C等位基因mRNA在肝癌和癌旁組織中表達(dá)水平的檢測(cè)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果，共統(tǒng)計(jì)了144個(gè)HLA-A、140個(gè)HLA-B、144個(gè)HLA-C等位基因mRNA定量表達(dá)的結(jié)果，其中肝癌相比于癌旁， HLA-A等位基因上調(diào)表達(dá)36.11％，表達(dá)一致47.92％，下調(diào)表達(dá)15.97％; HLA-B等位基因上調(diào)表達(dá)26.43％，表達(dá)一致43.57％，下調(diào)表達(dá)30％;HLA-C等位基因上調(diào)表達(dá)27.78％，表達(dá)

7、一致41.67％，下調(diào)表達(dá)30.55％。
　　4.作為抑制性KIR配體的HLA-Bw4表達(dá)上調(diào)比例(45.46％)高于非KIR配體的HLA-Bw6表達(dá)上調(diào)比例(20.95％)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.006)。抑制性KIR配體HLA-C*03在NK細(xì)胞活性高的KIR-BX個(gè)體中上調(diào)比例(62.5％)高于KIR-AA個(gè)體中的上調(diào)比例(14.29％)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.011)。
　　綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們?cè)O(shè)計(jì)并驗(yàn)證完成經(jīng)

8、典HLAⅠ類等位基因特異性的定量PCR引物，能夠定量分析同一HLA基因座位不同等位基因mRNA表達(dá)水平。在72例肝癌和癌旁組織中的研究結(jié)果表明，肝癌細(xì)胞中存在經(jīng)典HLAⅠ類等位基因選擇性得異常表達(dá)，且抑制NK細(xì)胞活性的HLA等位基因選擇性高表達(dá)，可能是肝癌細(xì)胞在NK細(xì)胞與CTL雙重免疫壓力下的免疫逃逸機(jī)制之一。
　　經(jīng)典HLAⅠ類等位基因特異性定量PCR引物的設(shè)計(jì)為同一HLA基因座位不同等位基因mRNA表達(dá)的定量定性分析提供了方法