肝癌細(xì)胞HepG2特異性結(jié)合雙價(jià)抗體的構(gòu)建、表達(dá)及鑒定.pdf

1、目的：從噬菌體抗體庫(kù)中篩選獲得的肝癌細(xì)胞HepG2特異性結(jié)合單鏈抗體(singlechainFv,scFv)，為進(jìn)一步提高其親合力(avidity)，構(gòu)建和表達(dá)與肝癌細(xì)胞HepG2特異結(jié)合的雙價(jià)抗體(BivalentsinglechainFv,BsFv)，鑒定其生物學(xué)活性，并和親本單鏈抗體進(jìn)行比較。 方法：①以與肝癌細(xì)胞特異結(jié)合的單鏈抗體SLH10基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)引物引入中間連接肽(G4S)及酶切位點(diǎn)AscI，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增

2、出兩個(gè)scFv片段，將其連接，并克隆至原核表達(dá)載體pAB1；②將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，挑取單克隆細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增，提取質(zhì)粒酶切、測(cè)序鑒定；③陽(yáng)性菌于23℃經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在不同時(shí)間點(diǎn)收集菌液進(jìn)行SDS-PAGE分析，并進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，確定最適表達(dá)條件后進(jìn)行大量表達(dá)，Ni2+-NTA層析柱純化抗體，對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析和Westernblot鑒定；④通過(guò)FCM測(cè)定純化產(chǎn)物與L02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞結(jié)合活性，并進(jìn)一

3、步測(cè)定與其他幾種腫瘤細(xì)胞株結(jié)合特性，比較BsFv、親本scFv親合力。 結(jié)果：①提取重組菌質(zhì)粒，酶切經(jīng)凝膠電泳可見(jiàn)約1500bp大小片段條帶，與BsFv基因大小相符；測(cè)序結(jié)果提示兩個(gè)擴(kuò)增基因片段以及中間連接肽序列正確無(wú)誤，表明BsFv構(gòu)建成功；②scFv及BsFv表達(dá)菌于23℃經(jīng)IPTG誘導(dǎo)隨時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白產(chǎn)量上升；收集處理誘導(dǎo)12h菌體，亞細(xì)胞定位分析提示細(xì)菌外周質(zhì)中存在目的蛋白表達(dá)，分子量大小分別為30kD、60kD左右，

4、與理論值相符；③經(jīng)IPTG誘導(dǎo)大量表達(dá)，收集上清超濾濃縮，收集菌體經(jīng)處理得到外周質(zhì)產(chǎn)物，所有產(chǎn)物經(jīng)Ni2+-NTA層析柱純化，并通過(guò)SDS-PAGE分析、Westernblot鑒定表明表達(dá)蛋白的分子量與理論值一致；④FCM分析純化抗體分別與幾種細(xì)胞株的結(jié)合活性，結(jié)果表明BsFv與親本scFv比較，與HepG2細(xì)胞結(jié)合率增加，與L02細(xì)胞及其他腫瘤細(xì)胞株結(jié)合率下降，表明BsFv與HepG2細(xì)胞株親合力有所增加。 結(jié)論：成功構(gòu)建與表